Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Resumen

Endocitosis regulado regula los niveles de expresión de la superficie celular de la mayoría de las proteínas de la membrana. Aquí se utilizan los reactivos reducible, la membrana impermeant biotinilación para medir la tasa de endocitosis del transportador de dopamina (DAT), una proteína de membrana politópica. El método facilita un método directo para medir la tasa de endocitosis de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática.

Resumen

Las proteínas de la membrana plasmática son un grupo grande y diverso de proteínas formado por los receptores, canales iónicos, transportadores y bombas. Actividad de estas proteínas es responsable de una variedad de importantes eventos celulares, incluyendo la entrega de nutrientes, la excitabilidad celular, y las señales químicas. Muchas proteínas de la membrana plasmática se regula de forma dinámica por el tráfico endocítica, que modula la función de proteínas mediante la alteración de la expresión de proteínas de la superficie. Los mecanismos que facilitan la endocitosis de proteínas son complejos y no son totalmente entendido por muchas proteínas de la membrana. Con el fin de entender completamente los mecanismos que controlan el tráfico endocítica de una proteína, es fundamental que la tasa de endocitosis de la proteína s medirse con precisión. Para muchos receptores, mediciones directas de la tasa de endocitosis son con frecuencia logra utilizando la etiqueta ligandos del receptor. Sin embargo, para muchas clases de proteínas de la membrana, como los transportistas, las bombas y los canales de iones, no hay ligando conveniente que puede ser usado para medir la tasa de endocitosis. En el presente informe, se describe un método reversible biotinilación que empleamos para medir el transportador de dopamina (DAT) Tasa de endocítica. Este método proporciona un método directo para medir las tasas de internalización, y puede ser fácilmente empleados para los estudios de tráfico de proteínas de membrana de la mayoría.

Protocolo

Descripción general del procedimiento:

Con este enfoque, proteínas de superficie celular son covalentemente marcado con biotina de disposición de residuos de lisina extracelular utilizando un impermeant membrana, disulfuro de acoplamiento reactivo biotinilación (sulfo-NHS-SS-biotina) en el tráfico de condiciones restrictivas (temperatura baja) (ver Fig. 1. por ejemplo). Un conjunto de células se desplaza a la trata de condiciones permisivas (37 ° C) e internalizar las proteínas con biotina. El otro conjunto de células se mantienen a baja temperatura, como los controles para: 1) la proteína de la superficie total en el momento = 0, y 2) el c....

Discusión

Los problemas más comunes: El problema más común que surge en estos experimentos es la eficiencia tira pobres. La eficiencia de la tira es fundamental para poder interpretar los resultados. A menos que la tira fue muy eficiente, no es posible concluir que todas las proteínas con biotina en los carriles de interiorización, de hecho, interiorizado de la superficie. Tiras de la eficiencia ≥ 90% son óptimas, y descartamos cualquier resultado si la tira cae por debajo de este nivel. Un ejemplo de una banda de pobres s.......