Mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras

1. Selección y la clonación de secuencias conservadas para las pruebas

1. Primero hay que identificar las posibles secuencias reguladoras de las pruebas funcionales. Contamos con la conservación de una secuencia evolutiva como un criterio para seleccionar las secuencias, y la mayoría utilizan a menudo el PhastCons algoritmo, que es accesible como una pista en la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Sin embargo, hay muchos otros algoritmos disponibles para evaluar la secuencia de conservación entre las especies.
2. Una vez que hayamos seleccionado a nuestro secuencias, diseño de cebadores para amplificar cada secuencia de ADN genómico. Cebadores deben ser seleccionados para amplificar la región conservada más 30 o más pares de bases a cada lado.
3. Para la amplificación de las secuencias seleccionadas se utiliza el sistema de Takara LA TaqTM. Otras polimerasas va a funcionar, pero es importante utilizar una mezcla que incluye una enzima con capacidad de corrección de pruebas, para reducir al mínimo las posibilidades de errores introducidos durante la amplificación. Verificamos el tamaño de amplificación por electroforesis en gel de agarosa.
4. Nosotros usamos la PCR 8/GW/TOPO TA Clonación Kit (Invitrogen) para clonar el producto de PCR en un vector de entrada que contiene los sitios attL recombinación, para generar el clon de la entrada de puerta de enlace. La reacción de la clonación es más eficiente con el nuevo producto de la PCR, lo que es mejor para llevar a cabo la clonación en un día de la PCR. Transformación de las cepas se realiza DH5a seguido por la selección resistencia a la espectinomicina.
5. Se verifica que el producto de la clonación TA por digestión de ~ 500 ng del plásmido con EcoRI para liberar la pieza, y confirmar el tamaño de la pieza por electroforesis en gel de agarosa. Se recomienda la secuenciación para verificar la secuencia de inserción y orientación; cebadores utilizados para la amplificación también puede ser utilizado para la secuenciación.
6. Desde el clon de la entrada, la secuencia no codificadora se conserva transportados por recombinación LR en nuestro vector de puerta de enlace destino listo, pGW_cfosGFP1, con puerta de enlace LR Clonase II de la enzima Mix (Invitrogen). Transformación de las cepas se realiza DH5a seguido por la selección de resistencia a ampicilina.
7. Se verifica que el producto de la recombinación LR por la digestión de ~ 500 ng del plásmido con EcoRV para liberar el inserto, y confirmar el tamaño de la pieza por electroforesis en gel de agarosa. Una vez que un clon exacto ha sido identificado, nos preparamos con el ADN del plásmido HiSpeed ​​Qiagen ® Kit Midi plásmido. Estamos más purificar el plásmido con el Kit QIAquick PCR Purificación, de acuerdo a los protocolos del fabricante, y eluir el ADN con 30 l RNasa libre de agua. El plásmido se diluye a una concentración de 125 ng / mL y almacenadas a 4 ° C antes de las inyecciones.
8. ARN que codifican funcional Tol2 enzima transposasa se ​​transcribe in vitro de la pDB600 plasmid2. Podemos purificar el plásmido con el Qiagen Midi-Prep kit, y luego alinear 10-20 mg con XbaI. La síntesis de ARNm se lleva a cabo siguiendo el protocolo mMESSAGE mMACHINE Kit (Ambion).
9. Nos purifica y precipitar el ARN de acuerdo con las instrucciones del kit. Nos resuspender ARN a una concentración final de ~ 1μg/μl, o 20 l para una sola reacción, en RNasa libre de agua, y cuantificar mediante espectrofotometría UV. Asimismo, se analizan ~ 1 g de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar la transcripción de larga duración. A pesar de un estándar de TAE o TBE gel es adecuado para este análisis, la muestra de amortiguación desnaturalización incluido en el kit de transcripción se debe utilizar de acuerdo a las instrucciones del kit.
10. Probamos cada nuevo lote de transposasa de ARN para la eficacia mediante la realización de inyecciones con un conocido plásmido (Figura 1). Tras la verificación, el ARN se divide en pequeñas partes alícuotas y almacenados a -80 ° C, para evitar la descongelación repetida y volver a congelar de alícuotas individuales.
    
    Figura 1. Embrión de pez cebra inyectados con el potenciador del ratón SOX10 como control. (Arriba) imagen campo claro (inferior) de imágenes de fluorescencia de GFP. Cada nuevo lote de transposasa ARN es la prueba de la eficacia.

2. Microinyección de embriones de pez cebra para el análisis de mosaico transgénicos

1. Tiramos las agujas para la microinyección de 1,2 mm de diámetro exterior de vidrio de filamento capilar en un Sutter P-97 Extractor Micropipeta, con un programa diseñado para dar un consejo fuerte, con una inclinación bastante agudo para penetrar coriones intacto. Rompemos las puntas a mano bajo un microscopio estereoscópico a un diámetro exterior de aproximadamente 15 micras, con una cuchilla limpia y un tobogán de micrómetro. Las agujas se puede hacer el día antes de las inyecciones, y se almacena en un plato de explotación objeto de mantener limpio.
2. Mantenemos nuestro pez cebra en un ciclo regular oscura luz, con 14 horas de luz, bajo la norma conditions3. El día antes de la realización de microinyecciones, hemos creado la pesca de apareamientos tiempo en los tanques de cría de pequeños, cada uno con un tanque de base, una inserción de ranuras, y una tapa de plástico. Ponemos tres hembras y dos machos por tank en filas paralelas.
3. En la mañana de la micro-inyecciones, poco después comienza el ciclo de luz, comenzamos la combinación de hombres y mujeres en la limpieza del sistema de agua tratada para la producción de huevos. Es importante comprobar el pescado con frecuencia, y recoger los huevos en unos pocos minutos de la puesta, para obtener lotes bien sincronizada. La producción de huevos se puede mantener durante dos o tres horas, al continuar combinar nuevos grupos de peces a lo largo de la mañana.
4. Con una amplia gama de diámetro, 5 1 / 4 "pipeta Pasteur de vidrio provista de un bulbo de látex, que ordenar los embriones obtenidos en 60 x 15 mm platos Petri, parcialmente lleno de embriones Medium2, en grupos de 50 embriones, y marcar el tiempo de recogida de la tapa de cada plato.
5. Una vez que los peces han comenzado a sentar, preparamos una solución nueva inyección mediante la mezcla de lo siguiente en un tubo de microcentrífuga en hielo:

   Componente
   Transposón plásmido de acciones (125ng/μl)	1μl
   Transposasa ARN de acciones (175ng/μl)	1μl
   Fenol sangre roja (2% en H 2 O)	0.5μl
   RNasa libre de agua	2.5μl

   
   Las agujas de inyección se colocan en la celebración de los platos y cubiertos por pipeteo 500 gotas nl de solución inyectable en el extremo ancho de cada aguja. Después de que el líquido se extrae a la punta por capilaridad, la solución adicional puede ser añadido a un total de 1,5 a 2 l. Nos preparamos por lo menos dos agujas para cada solución de la inyección.
6. La aguja llena se carga en la mano porta-agujas de un neumático Pico-bomba o similares en la presión de inyección, configurada y conectada a un tanque de N2 por las instrucciones del fabricante. Nos calibrar el volumen de inyección, midiendo el diámetro de las gotas expulsadas al aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro. Por lo general, un tiempo de inyección de 120 ms con una presión de 20 psi dará lugar a una gota de aproximadamente 1 nl, pero pequeñas variaciones en la aguja de diámetro afectará a estos parámetros y calibración puede ser necesaria entre las agujas.
7. Las inyecciones se realizan bajo un microscopio estereoscópico a las 6-10X de aumento. Nosotros usamos un par de pinzas finas para retener el embrión en su lugar, introducir la aguja de la inyección con una presión constante a través del corion y en la yema de un embrión en la celda de uno o dos primeras etapas de la célula. Lo ideal es que la posición de la punta de la aguja en la yema justo por debajo de los blastómeros. Aproximadamente 1 nl de solución inyectable es expulsado y se retira la aguja. Para construir cada uno se inyecta ≥ 200 embriones. También es muy importante, para cada nidada de embriones, para salvar a un plato de control de los embriones inyectados.
8. Después de las inyecciones que se han completado ordenar los embriones mediante la eliminación de huevos no fecundados, embriones dañados, y las inyecciones no (embriones sin rojo de fenol en blastómeros). A continuación, se incuban los embriones en un medio de embrión a 28,5 ° C hasta el momento apropiado para la observación.

3. Análisis de patrones de expresión del mosaico

1. Después de un tiempo de incubación adecuado, se examinan los embriones inyectados por fluorescencia. El tiempo dependerá del patrón de expresión normal del gen del pez cebra endógena, pero generalmente se ven todos los días durante los primeros 5 días después de la fecundación.
2. Se examinan los embriones de fluorescencia en un macroscopio Olympus MVX10 equipado para epifluorescencia, pero cualquier microscopio capaz de obtener imágenes similares bajo consumo de energía va a funcionar. Si hay un gran número de embriones que mueren o un desarrollo anormal en el primer día, mira los controles no inyectados para que el embrague para ver si se ven normales. Si los controles de aspecto normal, el problema más común es la pureza insuficiente del ADN inyectado. Además, los embriones en las primeras etapas son sensibles a la cantidad total de plásmido se inyecta, por lo que es posible que la cuantificación es inexacta y el ADN se inyecta demasiado.
3. Al examinar los embriones, tenga en cuenta que todos ellos serán de mosaico para la construcción de inyección. Será necesario examinar cuidadosamente todos los embriones, sobre todo si el dominio esperado de expresión es pequeño. También recuerda que la expresión puede ser dinámico, fuerte fluorescencia en el día 1 podrían desaparecer para el día 2, y los embriones negativos para la expresión de los 3 primeros días podrían mostrar algo en el día 4.
4. Hemos escogido algunos embriones con la expresión más amplia, y el uso de estos para documentar el patrón de fluorescencia por photomicroscopy. Después de 5 días de observaciones, los embriones deben ser devueltos a las instalaciones y se crió en una población. En varios meses, los adultos pueden ser examinados para la transmisión de la línea germinal de los transgenes.

4. Resultados

Vemos una gran variedad de los patrones y los niveles de expresión, según el elemento potenciador que se analiza. Por lo general estamos muy interesados ​​en los patrones de expresión específica de tejido, y con frecuencia se centra en los genes expresados ​​en el esqueleto. y con frecuencia se centra en los genes expresados ​​en el esqueleto. La figura 2 muestra ejemplos de los patrones de expresión de mosaico que hemos observado en nuestros embriones inyectados, con potenciadores de regulación de la expresión en el cartílago y el hueso. Finalmente, una parte sustancial de las secuencias de prueba no regulan la expresión específica de tejido. Para estos, la mayoría ven a menudo fluorescencia muy poco, tal vez unas pocas células esparcidas por embrión. Con menos frecuencia, podríamos ver la fluorescencia, pero sólo en dos sitios comunes para la expresión ectópica, la epidermis y el músculo esquelético (Figura 3).

Figura 2. Ejemplo de patrones de expresión de cartílago y hueso observados en los embriones inyectados.

Figura 3. Hay poca correlación entre la ubicación de la relación potenciador de la regulación de genes y de expresión. Una parte sustancial de las secuencias de prueba no regulan la expresión específica de tejido. Estos a menudo tienen fluorescencia muy poco, o tener dos sitios comunes para la expresión ectópica: la epidermis y el músculo esquelético. (Arriba) imagen campo claro (abajo) la fluorescencia de GFP de la imagen.

We have demonstrated the approach used in our laboratory for the efficient analysis of potential enhancers using zebrafish transgenesis. Most often, we use this approach to look for tissue-specific enhancers associated with human genes. Despite the lack of obvious sequence homology most of the time between human and fish non-coding sequences, we find that this approach is usually successful in identifying enhancers for the genes of interest to us. The critical factors for success are taking care in the preparation of the plasmid DNA and the transposase RNA, and injecting and examining a sufficient number of embryos for each construct. The general methods of transgene construction, embryo microinjections, and mosaic expression analysis would be applicable to generating transgenic zebrafish lines for many other purposes.