Las respuestas electrofisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas a los olores pueden ser medidos en los insectos a partir de grabaciones individuales sensillum. En este artículo de vídeo vamos a demostrar cómo realizar grabaciones individuales sensillum en las antenas de la mosca del vinagre ( Drosophila melanogaster) Y los palpos maxilares del mosquito de la malaria ( Anopheles gambiae).
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Artículo de método
Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae
En este artículo
Resumen
Resumen
El sentido del olfato es esencial para los insectos para encontrar los alimentos, los compañeros, los depredadores, y tres sitios de oviposición. Insectos neuronas olfativas sensoriales (OSN) se incluyen en pelos sensoriales llamados sensilla, que cubren la superficie de los órganos olfativos. La superficie de cada sensillum está cubierta de pequeños poros, a través del cual pasan los odorantes y se disuelven en un líquido llamado linfa sensillum, que baña las dendritas sensorial de la OSN ubicado en un sensillum dado. Las dendritas OSN expresa odorante del receptor (OR) de las proteínas, que en función de los insectos como los canales iónicos olor-4, 5. La interacción de las sustancias odoríferas con RUP, aumenta o disminuye la frecuencia de disparo basal de la OSN. Esta actividad neuronal en forma de potenciales de acción representa la primera representación de la calidad, la intensidad y características temporales de la sustancia odorífera 6, 7.
Teniendo en cuenta el fácil acceso a estos pelos sensoriales, es posible realizar grabaciones extracelulares de OSN solo por la introducción de un electrodo de registro en la linfa sensillum, mientras que el electrodo de referencia se sitúa en los ganglios linfáticos del ojo o del cuerpo del insecto. En Drosophila, sensilla casa entre una y cuatro OSN, pero cada OSN suele mostrar una característica de amplitud pico. Técnicas de clasificación de Spike permiten asignar las respuestas a clavar OSN individual. Este registro único sensillum (SSR) técnica monitorea la diferencia de potencial entre la linfa sensillum y el electrodo de referencia como los picos eléctricos que se generan por la actividad de los receptores de OSN 1, 2, 8. Los cambios en el número de picos en la respuesta al olor representan las bases celulares de la codificación de olores en los insectos. Aquí se describe el método de preparación se utilizan actualmente en nuestro laboratorio para llevar a cabo en la República Socialista Soviética de Drosophila melanogaster y el Anopheles gambiae, y mostrar las huellas representante inducida por los odorantes de una manera sensillum específicos.
Protocolo
1. Diluciones olor
- La mayoría de los olores son solubles en aceite de parafina. Sin embargo, DMSO o etanol también puede utilizarse como disolventes alternativos para los olores particulares. Prepare las diluciones adecuadas (por ejemplo, volumen 01:10: volumen, v: v) de olores puros en frascos de vidrio. La mayoría de las diluciones de olor son estables a temperatura ambiente, pero por muy volátiles, es mejor hacer diluciones de trabajo sobre una base semanal. Cada sensillum responde a los olores diferentes dentro de un rango de concentración diferente. De Drosophila, una útil tabla de consulta para las concentraciones adecuadas para su uso con un sensillum dado se pueden encontrar en 6, 7.
Para el experimento de vídeo, se utiliza el aceite de parafina como un control con disolvente y acetato de metilo (10 -6 v: v en aceite de parafina) y 1-octen-3-ol (10 -7 v: v en aceite de parafina) de Drosophila y Anopheles grabaciones, respectivamente. - Con la tijera, cortar el papel de cromatografía en 3 mm x 5 cm tiras para que puedan caber dentro de pipetas Pasteur.
- Pipeta 30 ul del olor deseado en una tira de papel filtro y se inserte en la pipeta de vidrio. Cortar 3 cm de tubo de la línea de aire y la inserta en el extremo abierto de la pipeta, cerrando con un conector. El conector se usa para sellar la pipeta que se adjunta a continuación el tubo de aire de línea de una bomba de aire cuando es el momento de entregar el olor durante el experimento.
2. Olor sistema de entrega
- El uso de un taladro pequeño, cortado a 10 ml de plástico pipeta serológica (por ejemplo, en la marca de 4 ml) y crear dos agujeros (por ejemplo, en el -1,5 y -0,5 ml marcas ml) que se utiliza para mantener las pipetas que contienen los olores. Introduzca la punta de pipeta de 200 l en el acoplador de púas e introducir el enganche en el extremo romo de la pipeta de 10 ml. La pipeta se utiliza como parte del sistema de suministro de sustancias odoríferas.
- Coloque la pipeta en un soporte magnético con una abrazadera de la pipeta y colocarla cerca del microscopio.
3. Afilar los electrodos
- Para afilar los electrodos, preparar una solución 0,5 M de hidróxido de potasio (KOH) y un filtro para eliminar las partículas finas (por ejemplo, utilizando un filtro m 45). Tome una jeringa de 20 ml y hacer un agujero pequeño (~ 2 mm de diámetro) con una aguja en la pared cerca de la punta (aproximadamente 1 cm de la punta), en el cual se inserta el cable eléctrico (fig. 1A).
- Llene la jeringa con 0,5 M de KOH, y fijarlo en un soporte bajo el microscopio para que la punta se coloca en el campo de visión (Figura 1 B, C). Inserte el cable eléctrico en el pequeño orificio en la pared de la jeringa (fig. 1B), asegurándose de que el cable no está directamente en frente de la entrada de la jeringa. Conecte el cable hasta el cátodo de un adaptador de corriente (por ejemplo, salvaje Heerbrugg MTR32, ver métodos) o un polo de una fuente de alimentación de CA (por ejemplo, salvaje Heerbrugg-LEP 990.018). Fijar el eje porta-electrodos en el micromanipulador manual en el lado derecho del microscopio, y conectar un cable eléctrico en la base del eje del soporte del electrodo con una pinza de cocodrilo. Conecte el cable hacia el ánodo de la fuente de alimentación o el otro polo de la fuente de alimentación de CA (Figura 1).
- Inserte el cable de tungsteno (~ 5 cm de longitud) en el porta-electrodos, y colóquelo en el eje porta-electrodos en el manipulador. Establecer la fuente de alimentación de 6 V, e inserte la punta de la aguja en la jeringa varias veces para perfeccionar, teniendo cuidado de vigilar la punta bajo el microscopio durante el proceso (fig. 1C). Para obtener un electrodo ideal para la grabación, el lugar del 90% de su longitud en la solución para un máximo de 1 minuto, y tire de ella lentamente. A continuación, inserte sólo ~ 50% de los electrodos para más delgada durante 30 s, y lo repito para obtener la punta de la aguja afilada (~ 10 veces).
La punta del electrodo debe ser lo suficientemente fina como para entrar en el sensillum, pero no tan bien como para doblar cuando se toca en las grabaciones (pasos 6 y 7). Aunque viendo la punta del electrodo bajo la lupa mientras se está afilado es una buena indicación de su espesor, la observan bajo el microscopio de grabación a gran aumento se dará una idea clara si un electrodo es adecuado para la grabación.
4. Insectos de preparación: Drosophila antena
- Construir un aspirador de volar. Cortar un trozo de tubo de la línea de aire el tiempo suficiente para colgar cómodamente alrededor de su cuello (de 90 a 120 cm). Corte la punta de una pipeta 200 l, y la inserta en un extremo del tubo. En el otro extremo posición, a ~ 1,5 cm x 1,5 cm pieza de malla para que se crea una barrera física, pero no impide que el aire fluya por el tubo. Corte la punta de una pipeta de 1 mL y la posición del extremo más ancho en la parte superior de la abertura del tubo, el bloqueo de la malla en el medio. Esta parte se utilizará para recoger y manipular las moscas adultas vinagre (Figura 2).
- Tome un portaobjetos y colocar un pedazo de cera dental aproximadamente en el centro del lado largo. En la parte superior de la positiona cubierta de vidrio ligeramente inclinado hacia arriba (~ 30), asegurándose de que la cera no está directamente debajo de la parte más alta, lo que impediría la visualización de la mosca del vinagre bajo el microscopio. Tirar de un electrodo de vidrio con el extractor vertical. Su punta debe ser delgada y lo suficientemente flexible como para adaptarse a entre el segmento antenal segunda y tercera, y mantener la estabilidad de la antena para las grabaciones. La posición del electrodo de vidrio en una pieza de cera y colóquelo en el lado de la cubierta de vidrio, lo suficiente para que cuando la punta se baja que llega a la esquina de la cubierta de vidrio (Figura 3).
- Trabajando a partir de una botella o frasco de las moscas adultas del genotipo deseado, recoger una mosca del vinagre para adultos usando el aspirador volar. Aunque las mujeres suelen ser utilizados debido a su mayor tamaño, los machos también se puede utilizar. Coloque una punta de pipeta de 200 l en la parte superior de la punta de 1 ml para evitar la marcha de escapar. Soplar en el tubo, por lo que la mosca es empujado hacia el final de la punta de la pipeta 200 mL. Recorte el extremo ancho de la punta de la pipeta con la cuchilla de afeitar de unos pocos milímetros de distancia de la propia marcha, a continuación, inserte un poco de cera para evitar que la marcha se salga. Bajo el microscopio, cortar de nuevo cerca de la cabeza de la mosca del vinagre, prestando atención para no dañar al animal. Con una pequeña punta de la pipeta, empujan la cera para forzar la cabeza de mosca de modo que aproximadamente la mitad de los ojos de extrusión de la punta (Figura 3B). Asegúrese de que sus piernas no salen así, o pueden moverse e interferir con las grabaciones.
- Montaje de la mosca en un pedazo de cera, con la cabeza mirando hacia arriba, y lo colocamos en la diapositiva en frente de la cubierta de vidrio. Empuje ligeramente la cabeza contra la esquina del cristal, de modo que las antenas se extienden y el resto en el cristal. Baje la punta del capilar de vidrio de entre el segmento antenal segundo y tercero (Figura 3B).
- Diferentes partes de la antena permitirá el acceso a tipos diferentes sensilla. Dependiendo de las necesidades particulares de experimentación, la antena deberá estar orientada de forma diferente para permitir el acceso a los tipos diferentes sensilla. Para grabar desde sensilla grandes basiconic como en nuestro ejemplo, la arista se empuja hacia abajo en el cristal (Figura 3B).
5. Insectos de preparación: Anopheles palpos maxilares
- El uso de un aspirador eléctrico (Figura 2E), recoger 40 a 60 días 3.5 mosquitos de edad (hombres y mujeres mezclados) en la jaula de plástico pequeñas (Figura 2F). Los mosquitos que han sido criados en condiciones normales, es decir, en una incubadora o insectos insectario a 25-28 ° C con un 70-80% de humedad. Coloque la caja de plástico con los animales en hielo durante ~ 15 minutos hasta que estén anestesiados por el frío. Una vez que los animales han dejado de moverse, la transferencia sólo 4-6 a los animales bajo el microscopio a la vez, manteniendo el resto de los animales sobre el hielo durante los procedimientos. Aunque las mujeres suelen ser utilizados debido a su sensibilidad al CO 2, los hombres también pueden ser empleados. Seleccione los mosquitos hembra o macho, a juzgar por la estructura de su antena (pluma-como en las mujeres, de filamento como en los hombres), y quitar las alas y las piernas con unas pinzas finas para inmovilizarlos. Manténgalos en un pequeño vaso de plástico con un papel húmedo en la parte inferior, para evitar la desecación.
- Poner dos pedazos de cinta de doble cara (aproximadamente 1 cm de longitud) paralelos entre sí (aproximadamente 1 cm de distancia), en el centro y en el lado de los portaobjetos de vidrio (Figura 3C). Con unas pinzas finas, coloque un mosquito en la cinta central, bajo el microscopio de disección, y girar de lado y meter el cuerpo y un ojo en la cinta. Ajustar la posición de los palpos maxilares de modo que ambos palpos se extienden en paralelo a la cinta (Figura 3D). Fijar los palpos maxilares mediante la colocación de cuerdas finas (por ejemplo, pelos humanos), tanto en la base y en la punta de los palpos (Figura 3D). La cinta parte se utiliza como depósito de cadenas finas, mientras que la cinta central tiene que ser reemplazado después de cada grabación (Figura 3C).
6. Grabación de Drosophila melanogaster
- Coloque el portaobjetos bajo el microscopio (Figura 4) a bajo aumento y la posición de la antena más o menos en el medio del campo de visión (FOV) (fig. 4B). Baje suavemente los electrodos para que el electrodo de referencia está situado cerca del ojo de la mosca y el electrodo de registro se encuentra cerca de la antena (Figura 4C). Aumentar la ampliación y re-posición de la antena en el centro del campo visual (Figura 4).
- Lugar la entrega olor dispositivo cerca de la cabeza de la marcha, que apunta a la antena.
- A bajo aumento (Figura 4C), insertar el electrodo de referencia en el ojo de la mosca. Baje el electrodo de registro en la parte superior de la antena sin tocar su superficie.
- El cambio a gran aumento, el control del electrodo de registro con el micromanipulador y la inserta en un sensillum seleccionado (Figura 4). Cualquier punto a lo largo sensillum es bueno para la grabación. Una vez dentro del sensillum, el electrodo puede ser empujado más lejos en la (a veces hasta el final)para obtener una mejor señal a ruido. Una vez que el electrodo está en el sensillum, la actividad espontánea de las células pueden ser detectadas.
7. Grabación de Anopheles gambiae
- Coloque la lámina de vidrio bajo el microscopio a bajo aumento (10x) y la posición de los palpos maxilares aproximadamente en el centro de el campo de visión y la cabeza en la parte superior (Figura 4). Gire el escenario hasta que uno de los palpos se encuentra en un ángulo recto con el electrodo de registro.
- Ajuste la altura de los electrodos de manera que el electrodo de referencia se sitúa justo por encima de los ojos de los mosquitos y el electrodo de registro se encuentra cerca de los palpos maxilares.
- Coloque el dispositivo de suministro de olor por lo que es lo más cerca posible de los palpos.
- Insertar el electrodo de referencia en el ojo a un menor aumento (10x), y el cambio a un aumento mayor (100x), insertar el electrodo de registro en el sensillum clavija en el palpo (Figura 4F). Una vez que el electrodo está en el sensillum, la actividad espontánea de las células pueden ser detectadas.
8. Los resultados representativos
Dependiendo de la sensillum y la calidad de la grabación, se pueden distinguir diferentes números de las neuronas olfativas en un solo rastro. En la sensilla grandes basiconic de Drosophila melanogaster, por ejemplo, entre 2 y 4 células que se diferencian en el pico de amplitud debería aparecer durante la grabación de 9, 10.
En nuestro experimento de vídeo, la Drosophila ab2 sensillum muestra dos células, una. Una célula (Figura 5, los picos de color azul) y una célula B (Figura 5, puntos verdes) Ni el celular se activa durante la aplicación de aceite de parafina (Figura 5), mientras que sólo la celda A responde a la dilución 10 -6 de acetato de metilo (Figura 5).
En el palpo maxilar del Anopheles gambiae, el ranurado sensillum vinculación contiene tres celdas, pero sólo dos son fácilmente discriminados (Figura 5, los picos de color azul y verde, respectivamente). En el experimento de vídeo que muestran cómo la célula B responde a una dilución de 10 -7 1-octen-3-ol (Figura 5D).
Figura 1. Electrodo afilador
(A) Vista general de los aparatos electrodo afilador. (B) La jeringa que contiene 0,5 M de KOH (izquierda) que se utiliza para afilar el electrodo (derecha). (C) Primer plano de la punta del electrodo al lado de la apertura de la jeringa.
Figura 2. Cómo preparar un aspirador de volar y el aspirador de mosquitos
(A) A partir de material:... La línea de aire un tubo de plástico, dos puntas de pipeta de corte, y la malla (B) El aspirador de volar una vez que se haya completado (C) Detalle de la final que se utiliza para atrapar las moscas del vinagre (D) Detalle de el otro extremo del aspirador volar. (E) El aspirador eléctrico para la recolección de mosquitos se compone de un cuerpo principal y una jaula de plástico extraíble. (F) La jaula de plástico extraíble para los mosquitos.
Figura 3. Preparación de una mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) y un mosquito de la malaria (Anopheles gambiae) para la grabación
(A) Imagen de un vinagre de volar montado en la diapositiva antes de colocar bajo el microscopio. (B) Detalle de la cabeza de mosca del vinagre con la antena mantiene en su lugar por los capilares de vidrio. (C) Imagen de un mosquito montado en la diapositiva. (D) Detalle de la cabeza del mosquito con trompa y palpos se pegue en la cinta.
Figura 4. Grabación de una mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) y un mosquito de la malaria (Anopheles gambiae)
(A) Vista de la instalación de electrofisiología. (B) Primer plano de la preparación volar montado en el microscopio. Observe la posición respectiva de los electrodos de grabación (izquierda), el sistema de entrega de olor (en el centro pipeta), y el electrodo de registro (derecha). (C) Imagen de la marcha bajo el objetivo de 10x. (D) Imagen de la antena de la mosca en el objetivo de 100x;. sensilla grandes basiconic (flechas), intercalados entre los no-sensorial pelos (puntas de flecha) (E) 10 veces vista de un mosquito montado para la grabación (F) ver gran aumento de los mosquitos y palpo una sensillum peg (flecha). .
Figura 5. Ejemplos de las grabaciones de Drosophila melanogaster yAnopheles gambiae
(A) El sensillum ab2 de Drosophila melanogaster contiene dos neuronas sensoriales;.. A la celda (los picos de color azul) y de células B (picos verde) (B) Las células A y B durante la aplicación del acetato de metilo 10 -6 (C) El peg sensillum de Anopheles gambiae dos casas neuronas sensoriales, las células A (picos de color azul) y de células B (picos verde) (D) Aplicación de 10 -7 1-octen-3-ol para la sensillum tipo de cambio..
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Discusión
Señales olfativas son utilizadas por los organismos para identificar las fuentes de alimentos, posibles parejas, y los depredadores. Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) es el centro de primer relevo entre los estímulos externos y los centros superiores del cerebro donde se ve la información procesada. En Drosophila melanogaster y el Anopheles gambiae, OSN son fácilmente accesibles y su actividad eléctrica se puede monitorizar mientras estimulado por bocanadas de olor.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Aceite de parafina | Olores | Fluka | 76235 | |
| Olores de alta pureza (>98%) | Olores | Sigma-Aldrich | Acetato de metilo #296996 1-octen-3-ol #74950 | |
| Tiras de papel de filtro | Olores | Fisher Scientific | 05-714-1 | Papel cromatográfico |
| Conectores | Olores | Cole-Parmer | EW-06365-40 | 1/16x1/8" |
| Viales de vidrio | Olores | Agilent Technologies | 5182-0556 | |
| Tubo plástico para línea de aire | Entrega de olores | Python Products | 500PAL | |
| 1 pipeta serológica | Entrega de olores | Corning | 4101 | 10 mL |
| Tubo plástico | Entrega de olores | Cole-Parmer | EW-06418-0 | 0.050"x0.090"OD |
| Pipetas Pasteur desechables de vidrio borosilicato | Entrega de olores | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5-3/4 pulgadas |
| Controlador programable de estímulos | Entrega de olores | Syntech | CS-55 | |
| Mesa antivibración | Equipamiento de electrofisiología | TMC | 63533 | 36”Anx30”Profx29”Al |
| Jaula de Faraday | Equipamiento de electrofisiología | TMC | MI8133303 | |
| Microscopio invertido | Equipamiento de electrofisiología | Nikon Instruments | E600FN ECLIPSE | Microscopio de grabación |
| Objetivos de 10x y 100x | Equipamiento de electrofisiología | Nikon Instruments | 10x Plan Fluor 100x L Plan | |
| Microscopio estereoscópico | Equipamiento de electrofisiología | Nikon Instruments | EZ645 | Microscopio para afilar electrodos y preparación de insectos |
| Soportes magnéticos | Equipamiento de electrofisiología | Newport Corp. | MODEL 150 | |
| IDAC | Equipamiento de electrofisiología | Syntech | IDAC-4 | |
| Software de adquisición | Equipamiento de electrofisiología | Syntech | Autospike | |
| 1 macromanipulador | Equipamiento de electrofisiología | Narishige International | MN-151 | Manipulador con joystick Utilizado para posicionar el electrodo de referencia |
| 1 micromanipulador | Equipamiento de electrofisiología | EXFO | PCS-6000 | Utilizado para posicionar el electrodo de registro |
| Cocodrilo (pinza) | Equipamiento de electrofisiología | Pomona | AL-B-12-0 | |
| Cable eléctrico | Equipamiento de electrofisiología | Pomona | B-36-0 | Conjunto de cable de prueba |
| 2 soportes para electrodos | Equipamiento de electrofisiología | Syntech | N/A | Soportes para electrodos (juego de 2) para electrodo de alambre de tungsteno |
| Probador AC | Equipamiento de electrofisiología | Syntech | N/A | Probador universal de extremo simple (10xAC) |
| Electrodos de tungsteno | Equipamiento de electrofisiología | Microprobes | M210 | varillas rectas de tungsteno, 0.005x3 |
| Hidróxido de potasio | Equipamiento de electrofisiología | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Jeringa | Equipamiento de electrofisiología | BD Biosciences | 301625 | 20 mL |
| Fuente de alimentación | Equipamiento de electrofisiología | Wild Heerbrugg | e.g MTR32 | |
| Traccionador vertical | Preparación de insectos | Narishige International | PB-7 | |
| Cuchilla de afeitar | Preparación de insectos | VWR international | 55411-050 | |
| Cera dental | Preparación de insectos | Patterson | 091-1503 | |
| Portaobjetos microscópico | Preparación de insectos | Fisher Scientific | 12-550A | |
| Cubreobjetos | Preparación de insectos | Fisher Scientific | 12-541A | 18X18 #1.5 |
| Malla de polipropileno | Preparación de insectos | Small Parts, Inc. | CMP-0500-B | |
| Electrodo de vidrio | Preparación de insectos | Frederick Haer and Co. | 27-32-0-075 | Tubo capilar de vidrio borosilicato 1,5 mm de diámetro exterior x 1,12 mm de diámetro interior x 75 mm |
| Cinta adhesiva doble cara (3M) | Preparación de insectos | 3M | MMM6652P3436 | Cinta adhesiva doble cara (3M) |
| Pinzas | Preparación de insectos | Fine Science Tools | 021x0053 | Pinzas Dumont #5 con acabado espejo |
| Vaso plástico pequeño | Preparación de insectos | VWR international | 89009-662 | 7 x 5,7 (23/4 x 21/4) |
| Aspirador eléctrico | Preparación de insectos | Gempler’s | RHM200 |
Referencias
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- Hallem, E. A., Fox, A. N., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant. Nature. 427, 212-213 (2004).
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- Fishilevich, E., Vosshall, L. B. Genetic and functional subdivision of the Drosophila antennal lobe. Curr Biol. 15, 1548-1553 (2005).
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Reimpresiones y permisos
