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Parte 1: Preparación del campo operatorio
- El campo de operación se desinfecta con un 75% de alcohol isopropílico.
- Asegúrese de que el cojín de la calefacción está encendida y en la temperatura correcta. Un sistema recomendado es un Gaymar bomba de circulación de agua conectados a una plataforma de terapia que se mantiene a 37 ° C ± 1 ° C. Es importante mantener la temperatura corporal normal durante la cirugía para evitar una rápida disminución de la frecuencia cardíaca.
- Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en un esterilizador de calor de cuentas antes de la cirugía. Para este procedimiento, tendrá los siguientes instrumentos quirúrgicos: tijeras de punta roma, por supuesto curva X 2 pinzas, pinzas finas en ángulo de 45 ° X 2, tijeras en ángulo de primavera, retractor en el pecho, y soporte de la aguja.
- Aplicadores de algodón se debe a la mano en caso de hemorragia.
Parte 2: Preparación y la intubación de los ratones
- Los ratones son anestesiados en una cámara de inducción con isoflurano 2% mezclado con 0.5 -1.0 L / min 100% de O 2.
- Cortar el pelo se utilizan para afeitar la piel del escote a la altura del pecho medio.
- El ratón es colocado en posición supina sobre un cojín de la calefacción con el fin de mantener la temperatura corporal.
- Una banda de goma se coloca sobre los dientes delanteros del animal s para extender el cuello. El uso de pinzas curvas en una mano, la lengua es manipulado suavemente a un lado. Con la otra mano, la intubación endotraqueal se realiza con tubería de PE 90. El tubo endotraqueal se conecta a un volumen de Harvard de ciclo en ciclo del ventilador roedores 125-150 respiraciones / minuto y un volumen corriente de 0.1-0.3 ml. Durante la intervención quirúrgica, la anestesia se mantiene en 1,5 a 2% de isoflurano con 0,5 a 1,0 L / min 100% de O 2. Nivel correcto de la anestesia se verifica mediante la aplicación de presión sobre el lecho de la uña del ratón (dedo del pie-una pizca de reflejos).
- El campo quirúrgico se desinfecta con una solución de betadine seguido por 70% de alcohol. Este procedimiento se repite tres veces.
- Para evitar la contaminación del campo quirúrgico durante la operación, un campo estéril se coloca sobre el ratón dejando sólo el campo de operaciones al descubierto.
- Un par de guantes estériles se utiliza para cada ratón individual.
Parte 3: La ligadura de la aorta transversa
- Toracotomía parcial de la segunda costilla se realiza bajo un microscopio quirúrgico y el esternón se retractó de usar un separador en el pecho.
- Punta fina pinza en ángulo de 45 ° se utilizan para separar suavemente el tejido del timo y la grasa del arco aórtico.
- Tras la identificación de la aorta transversa, una pequeña pieza de una sutura de seda 6.0 se coloca entre las arterias carótidas innominada y la izquierda (Figura 1).
- Dos nudos sueltos se atan alrededor de la aorta transversa y una pequeña pieza de un 27 ½ aguja roma de calibre se coloca paralelo a la aorta transversa. El primer nudo es atado rápidamente en contra de la aguja, seguida por la segunda y la aguja se eliminan sin demora con el fin de producir una contracción de 0,4 mm de diámetro. En los ratones control con tratamiento simulado, todo el procedimiento es idéntico, excepto para la ligadura de la aorta.
- El retractor se quita el pecho y la salida del ventilador apagado apretado durante 2 segundos para volver a inflar los pulmones.
- La caja torácica se cierra con una sutura de prolene 6.0 con un patrón de sutura interrumpida.
- La piel se cierra con una sutura de prolene 6.0 con un patrón de sutura continua.
Parte 4: recuperación post-operatoria
- Para la analgesia postoperatoria, el ratón se inyecta con buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía intraperitoneal. Si hay signos de deshidratación después de la cirugía, se le da una solución salina estéril por vía intraperitoneal.
- La anestesia es rebajarse gradualmente a la posición de apagado y el tubo endotraqueal eliminado cuando los signos de respiración espontánea se producen.
- El ratón se mueve a la posición prona y les permitió recuperarse de una almohadilla eléctrica.
Parte 5: Confirmación de la ligadura de éxito de la aorta transversa
- Una semana después de TAC, el ratón se re-anestesia para determinar el grado de sobrecarga de presión inducida por la ligadura de la aorta transversa. Como se describió anteriormente, la anestesia se mantiene en 1,5 a 2% de isoflurano con 0,5 a 1,0 L / min 100% de O2 y la temperatura corporal se mantuvo a 37 ° C ± 1 ° C.
- A 20 MHz Doppler sonda se coloca en los lados izquierdo y derecho del cuello en un ángulo de 45 ° para detectar velocidades de flujo. Un ordenador basado en procesador de señales Doppler (Indo Instruments, Houston, TX) se utiliza para mostrar y almacenar señales de Doppler. 5
- Dependiendo del grado de sobrecarga de presión necesario para el protocolo experimental, los ratones sólo con una carótida derecha (RC) / carótida izquierda (LC) la relación de flujo dentro de cierto rango se incluyen para su posterior análisis. Por ejemplo, un moderado grado de sobrecarga de presión lleva a una proporción de 5-8, mientras que una contracción más estrecha que resulta en una sobrecarga de presión severa lleva tOA cociente de 8.10 (Figura 5.3A). Un animal simulado (operado, pero no ligado), sin embargo, se espera que tenga una proporción de ~ 1 (Figura 5.3b).
6: Resultados de Representante
La supervivencia típica quirúrgica después de la TAC en ratones de tipo salvaje es alrededor de 80-90%. La ligadura quirúrgica exitosa de la aorta transversa dará lugar a una relación de velocidad Doppler del flujo entre la arteria carótida derecha y la izquierda (RC / LC) de 10.5 (Figura 1). En comparación con el simulacro que funciona con los ratones (Figura 2A), los ratones con sobrecarga de presión se espera que se desarrolle la hipertrofia cardiaca en 1-2 semanas, y la dilatación cardiaca después de 6-8 semanas, dependiendo de la tensión de la contracción (Figura 2B). La mortalidad durante el primer mes después de la TAC es más baja (<20%) en ratones de tipo salvaje, a pesar de ratones modificados genéticamente pueden presentar diferentes tasas de supervivencia 6,7.
Figura 1. La confirmación de la ligadura de la aorta transversal con Doppler de medición de velocidad. Representante de las señales de velocidad Doppler de la derecha (CD) y la arteria carótida izquierda (LC) 6 días después de la TAC. Estas grabaciones demuestran una ligadura de éxito con un ratio de flujo de RC / LC de ~ 6.8. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
Figura 2. Imágenes representativas de todo corazón Después de TAC. A, B. Sham-operado del corazón salvaje del ratón tipo.. Corazón salvaje del ratón tipo 16 semanas después de la TAC. Cada línea = 1 mm.
