Summary
مستعرضة انقباض الأبهر (TAC) في الفأر نموذج استخداما تجريبيا لدراسة الآليات الكامنة وراء تضخم القلب والقلب التنمية الفشل. هنا ، نحن تصف إجراءات لتقليص الأبهر لخلق درجة استنساخه من تضخم القلب في الفئران.
Abstract
مستعرضة انقباض الأبهر (TAC) في الماوس هو نموذج تجريبي استخداما للضغط الزائد الناجم عن تضخم القلب وقصور في القلب.
Protocol
الجزء 1 : إعداد حقل التشغيل
- وتطهيرها مجال التشغيل مع ايزوبروبيل 75 ٪.
- تأكد من وسادة التدفئة وعلى الحق في درجة الحرارة. نظام المقترح هو Gaymar ضخ المياه المنتشرة متصلا لوحة العلاج التي تم الاحتفاظ ب 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية. فمن المهم للحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية أثناء الجراحة لتفادي انخفاض سريع في معدل ضربات القلب.
- يتم تعقيم الأدوات الجراحية في التعقيم حبة الساخن قبل الجراحة. لهذا الإجراء ، سوف تحتاج الصكوك التالية الجراحية : مقص حادة ، وبطبيعة الحال منحني ملقط X 2 ، ودفع غرامة 45 درجة الزاوية ملقط X 2 ، ربيع مقص الزاوية ، مبعاد الصدر وحامل الإبرة.
- ينبغي تطبيقها سيكون على يد القطن في حالة النزيف.
الجزء 2 : إعداد وتركيب الانبوبة من الفئران
- يتم تخدير الفئران في غرفة التعريفي مع 2 ٪ isoflurane مختلطة مع 0.5 -1.0 لتر / دقيقة 100 ٪ O 2.
- يتم استخدام الشعر كليبرز حلق الفراء من العنق إلى مستوى وسط الصدر.
- يتم وضع الماوس في وضع الاستلقاء فوق وسادة التدفئة من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم.
- يتم وضع الشريط المطاطي على الأسنان الأمامية للحيوان ليالي لتمديد الرقبة. باستخدام الملقط المنحني في يد واحدة ، يتم التلاعب بها اللسان برفق إلى الجانب. مع من ناحية أخرى ، يتم تنفيذ التنبيب الرغامي استخدام أنابيب PE 90. ثم يتم توصيل الأنبوب الرغامي إلى وحدة تخزين ، تدوير هارفارد القوارض الدراجات التنفس الصناعي في الأنفاس 125-150 / دقيقة وحجم المد والجزر من 0.3ml - 0.1. أثناء العملية الجراحية ، والتخدير في المحافظة 1،5-2 ٪ isoflurane مع 0،5-1،0 لتر / دقيقة 100 ٪ O 2. يتم التحقق من المستوى الصحيح للتخدير عن طريق الضغط على الماوس الظفر (إصبع القدم قرصة منعكس).
- وتطهيرها والجراحي الميداني مع الحل betadine تليها الكحول 70 ٪. ويتكرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
- لمنع التلوث من الحقل خلال العملية الجراحية ، يتم وضع ثنى العقيمة على الماوس ولم يتبق سوى عملية الميدانية عرضة للخطر.
- وتستخدم مجموعة من القفازات المعقمة لكل فرد الماوس.
الجزء 3 : ربط الشريان الأورطي المستعرض
- يتم تنفيذ جزئي لبضع الصدر الضلع الثاني تحت المجهر الجراحي والقص تراجع باستخدام مبعاد الصدر.
- غيض غرامة 45 درجة وتستخدم ملقط الزاوية لفصل بلطف الأنسجة والدهون من الغدة الصعترية قوس الأبهر.
- بعد التعرف على الأبهر عرضية ، يتم وضع قطعة صغيرة من الحرير 6.0 خياطة الشرايين السباتية بين اللامسمى واليسرى (الشكل 1).
- وترتبط اثنين عقدة فضفاضة حول الأبهر عرضية وقطعة صغيرة من 27 ½ يتم وضع إبرة حادة موازية لقياس الأبهر عرضية. يرتبط بسرعة عقدة الاولى ضد الإبرة ، تليها الثانية وإزالة الإبرة فورا من أجل تسفر عن انقباض 0.4mm في القطر. التحكم في الفئران صورية ، فإن الإجراء بأكمله متطابقة باستثناء ربط الشريان الأورطي.
- تتم إزالة مبعاد الصدر وتدفق للخارج التنفس الصناعي لمدة 2 ثانية مقروص لإعادة تضخيم الرئتين.
- إغلاق القفص الصدري باستخدام خياطة prolene 6.0 مع نمط خياطة توقف.
- إغلاق خياطة الجلد باستخدام prolene 6.0 مع وجود نمط مستمر خياطة.
الجزء 4 : في مرحلة ما بعد المنطوق الاسترداد
- لتسكين بعد العملية ، يتم حقن الفأر مع البوبرينورفين (0،1 ملغ / كلغ) intraperitoneally. إذا كانت هناك علامات الجفاف بعد الجراحة ، ويتم إعطاء المالحة intraperitoneally العقيمة.
- وخفضت تدريجيا تخدير للموقف قبالة وإزالة الأنبوب الرغامي عند ظهور علامات التنفس العفوي يحدث.
- يتم نقل الماوس إلى وضعية الانبطاح وسمح لاسترداد على وسادة التدفئة.
الجزء 5 : تأكيد نجاح عملية ربط الشريان الأورطي المستعرض
- بعد أسبوع واحد تاك ، والفأر هو إعادة تخدير لتحديد درجة من الضغط الزائد الناتج عن ربط الشريان الأورطي عرضية. كما هو موضح أعلاه ، يتم الاحتفاظ التخدير في 1،5-2 ٪ isoflurane مع 0،5-1،0 لتر / دقيقة 100 ٪ O 2 والحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية.
- يتم وضع مسبار دوبلر 20 ميغاهيرتز على الجانبين الأيسر والأيمن من الرقبة بزاوية 45 درجة للكشف عن تدفق السرعات. تم استخدام الكمبيوتر المستندة إلى معالج الاشارات دوبلر (اندوس الآلات ، وهيوستن ، تكساس) لعرض وتخزين الاشارات دوبلر 5
- اعتمادا على درجة من الضغط الزائد اللازم لبروتوكول تجريبي ، يتم تضمين فقط مع الفئران السباتي الأيمن (RC) / يسار السباتي (LC) نسبة التدفق داخل نطاق معين لمزيد من التحليل. على سبيل المثال ، وعلى درجة معتدلة من الضغط الزائد يؤدي إلى نسبة 5-8 ، في حين أن أكثر تشددا مما أدى إلى تقليص عبء ضغط شديد يؤدي رOA نسبة 80-10 (الشكل 5.3A). حيوان صورية (لا تعمل إلا ligated) ، ومع ذلك ، فمن المتوقع أن يكون لها نسبة من ~ 1 (الشكل 5.3B).
6 : نتائج الممثل
بقاء نموذجية الجراحية التالية TAC في البرية من نوع الفئران حوالي 80-90 ٪. وربط جراحية ناجحة في الشريان الأورطي عرضية يؤدي إلى سرعة تدفق دوبلر نسبة بين الشريان السباتي الأيمن والأيسر (RC / LC) من 50-10 (الشكل 1). بالمقارنة مع الفئران التي تديرها صورية (الشكل 2A) ، ومن المتوقع أن الفئران مع الضغط الزائد على وضع تضخم القلب في غضون 1-2 أسابيع ، وبعد توسع القلب 6-8 أسابيع ، تبعا لضيق للانقباض (الشكل 2B). الوفيات خلال الشهر الأول بعد TAC منخفضة عادة (<20 ٪) في الفئران من النوع البري ، على الرغم من الفئران المعدلة وراثيا قد يحمل معدلات البقاء على قيد الحياة المختلفة. 6،7
الشكل 1. تأكيدا لربط الأورطي باستخدام مستعرض دوبلر قياس السرعة. إشارات الممثل سرعة دوبلر للحق (RC) وترك الشرايين السباتية (LC) 6 أيام ما بعد معاهدة الصداقة والتعاون. هذه التسجيلات يبرهن على وجود ربط ناجحة مع نسبة تدفق RC / LC من ~ 6.8. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2. ممثل صور القلب الجامع عقب تاك. ألف وباء. الشام التي تديرها الماوس نوع البرية القلب. نوع البرية قلب فأر بعد 16 أسبوعا تاك. كل سطر = 1MM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تاك ، الذي يحاكي الإنسان تضيق الأبهر ، هو طريقة شائعة للحث على تضخم القلب وقصور في القلب لدى الفئران. مواقع بديلة لانقباض الأبهر تشمل الأبهر الصاعد والبطن. تصاعدي انقباض الأبهر يوفر الزائد المدقع وأكثر سرعة في البطين الأيسر (LV). في المقابل ، انقباض البطن الأبهر يترك الحبل على الغارب لأكبر نسبة من التداول كوسيلة للتعويض محتمل. 8 لذلك ، غالبا ما تكون معاهدة الصداقة والتعاون هو النموذج المفضل ، لأنه ينص على الوقف الكافي الزائد بطريقة تعتمد على الوقت أكثر قابلية للتحقيق. على الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية ، مع الممارسة ، حققنا معدل البقاء على قيد الحياة من 80-90 ٪ في الفئران نوع البرية.
وضيق الشريان الأورطي انقباض عرضية يحدد درجة تطور وتضخم في الإطار الزمني الذي فشل القلب وتوسع يتطور. علاوة على ذلك ، عمر الفئران يؤثر على معدل الاسترداد وحركية التنمية قصور في القلب. الفئران الأكبر سنا (> 12 شهرا من العمر) وقتا أطول لتطوير استجابة التكيفية للالشرايين السباتية لمعاهدة الصداقة والتعاون ، ويرجح أن تطوير تمدد عضلة القلب أسرع من الفئران الأصغر سنا (3-4 أشهر من العمر). 5
غير الغازية التنبيب من الفئران يأخذ بعض الممارسة. طريقة بديلة على النحو التالي :
- يتم إجراء شق صغير خط الوسط عنق الرحم مع مقص كليلة والأنسجة فصل حول القصبة الهوائية باستخدام الملقط منحنية من أجل فضح القصبة الهوائية.
- يتم وضع قطعة من الخيط حول الأسنان الأمامية وانسحب بلطف بعيدا عن جسم الحيوان لتمديد الرقبة.
- باستخدام الملقط المنحني في يد واحدة ، يتم التلاعب بها اللسان برفق إلى الجانب.
- مع من ناحية أخرى ، يتم تنفيذ التنبيب الرغامي استخدام أنابيب PE 90 مشطوف على حافة لسهولة الدخول.
ثم يتم توصيل الأنبوب الرغامي إلى وحدة تخزين ، تدوير هارفارد القوارض الدراجات التنفس الصناعي في الأنفاس 125-150 / دقيقة وحجم المد والجزر من 0.3ml - 0.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW هو كيك WM كلودج مؤسسة الشباب في البحوث الطبية ، وأيضا على دعم من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI المنح R01 - R01 HL089598 وR01HL091947 ، والضمور العضلي جمعية المنحة # 69238. RJvO وهو حاصل على زمالة جمعية الفسيولوجية الأمريكية 2008-2010 بعد الدكتوراه في علم الجينوم الفسيولوجية. كما يدعم هذا العمل في جزء من مؤسسة التحالف من أجل Leducq كناس CaMKII في اشارة الى القلب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
