Summary
Tvärgående aorta sammandragning (TAC) i musen är ett vanligt använt experimentell modell för att studera mekanismerna bakom hjärthypertrofi och hjärtsvikt utveckling. Här beskriver vi rutiner för att tygla den stora kroppspulsådern för att skapa en reproducerbar viss kardiell hypertrofi hos möss.
Abstract
Tvärgående aorta sammandragning (TAC) i musen är ett vanligt experimentell modell för övertryck-inducerade hjärthypertrofi och hjärtsvikt.
Protocol
Del 1: Förberedelser för drift Field
- Det operativa området är desinficeras med 75% isopropylalkohol.
- Se till värmedynan är på och vid rätt temperatur. En rekommenderad system är en Gaymar cirkulerande vatten pump ansluten till en terapi pad som hålls vid 37 ° C ± 1 ° C. Det är viktigt att upprätthålla en normal kroppstemperatur under operation för att undvika en snabb minskning av hjärtfrekvensen.
- Kirurgiska instrument är steriliserade i en varm pärla autoklav innan operationen. För denna procedur behöver du följande kirurgiska instrument: trubbig sax, naturligtvis böjd pincett X 2, fin 45 ° vinklat pincett X 2, vinklad våren sax, bröst upprullningsdon och nål.
- Bomull applikatorer bör finnas till hands i händelse av blödning.
Del 2: Förberedelser och intubation hos möss
- Möss är bedövas i en induktion kammare med 2% isofluran blandat med 0,5 -1,0 l / min 100% O 2.
- Hårklippningsmaskiner används för att raka pälsen från halsen till mitten av bröstet nivå.
- Musen placeras i ryggläge ovanpå en värmedyna för att hålla kroppstemperaturen.
- Ett gummiband placeras över djurets s framtänder att förlänga nacken. Använda böjd pincett i ena handen, är tungan försiktigt manipulerade åt sidan. Med den andra sidan är endotrakeal intubation utförs med hjälp av PE 90 rör. Den endotrakealtub kopplas sedan till en Harvard volym-cyklade gnagare ventilator cykla på 125-150 andetag / minut och en tidalvolym på 0,1-0.3ml. Under kirurgiskt ingrepp, är anestesi hållas på 1,5-2% isofluran med 0,5 till 1,0 l / min 100% O 2. Korrekt nivå av anestesi verifieras genom att sätta press på musen nagelbädden (toe-nypa reflex).
- Den kirurgiska området desinficeras med Betadine lösning följt av 70% alkohol. Denna procedur upprepas tre gånger.
- För att förhindra kontamination av operationsområdet under operationen, är en steril duk placeras över musen lämnar endast drift fältet utsatt.
- En uppsättning av sterila handskar används för varje enskild mus.
Del 3: Ligation det tvärgående Aorta
- Partiell torakotomi andra revbenet utförs under en kirurgisk mikroskop och bröstbenet indragen med hjälp av en kista upprullningsdon.
- Fin spets 45 ° vinklat peang används för att försiktigt separera bräss och fettvävnad från aortabågen.
- Efter identifiering av tvärgående kroppspulsådern, är en liten bit av en 6,0 siden sutur placeras mellan innominate och vänster halspulsåder (Figur 1).
- Två lösa knutar knyts runt tvärgående kroppspulsådern och en liten bit av en 27 ½ är gauge trubbig nål placeras parallellt med den tvärgående aorta. Den första knut snabbt bunden mot nålen, följt av den andra och nålen omedelbart bort för att ge en sammandragning av 0,4 mm i diameter. I bluff kontroll möss, är hela proceduren identiska med undantag av ligation av aorta.
- Kistan upprullningsdon tas bort och utflödet av ventilatorn klämde ut 2 sekunder för att blåsa upp lungorna.
- Bröstkorgen stängs med en 6,0 prolene sutur med en avbruten sutur mönster.
- Huden är stängt med en 6,0 prolene sutur med en kontinuerlig sutur mönster.
Del 4: postoperativ återhämtning
- För postoperativ smärtlindring, är den mus injiceras med buprenorfin (0,1 mg / kg) intraperitonealt. Om det finns tecken på uttorkning efter operation är steril koksaltlösning ges intraperitonealt.
- Anestesi successivt sänkas till läge OFF och endotrakealtub bort när tecken på spontan andning förekomma.
- Musen flyttas till liggande och får återhämta sig på en värmedyna.
Del 5: Bekräftelse av Framgångsrik Ligation det tvärgående Aorta
- En vecka efter TAC, är musen igen sövda för att avgöra graden av trycket överbelastning orsakas av ligation det tvärgående aorta. Som beskrivits ovan är anestesi hållas på 1,5-2% isofluran med 0,5 till 1,0 l / min 100% O 2 och kroppstemperaturen hålls vid 37 ° C ± 1 ° C.
- En 20 MHz-doppler sond placeras på vänster och höger sida av halsen på en 45 ° vinkel för att upptäcka flödeshastigheter. Ett datorbaserat Doppler signalprocessor (Indus Instrument, Houston, TX) användes för att visa och lagra Doppler signaler. 5
- Beroende på graden av tryck överbelastning som behövs för den experimentella protokoll, endast möss med en rätt halspulsådern (RC) / vänster halspulsådern (LC) flöde förhållandet inom ett visst intervall inkluderas för vidare analys. Exempelvis ger en måttlig grad av övertryck till ett förhållande på 5-8, medan en tätare sammandragning vilket resulterar i stor press överbelastning leder toa förhållandet mellan 8-10 (figur 5.3A). En bluff djur (används men inte knyts ihop), men förväntas ha ett förhållande på ~ 1 (figur 5.3B).
6: representativa resultat
Den typiska kirurgiska överlevnaden efter TAC vildtyp möss är cirka 80-90%. Framgångsrik kirurgisk ligation det tvärgående aorta kommer att leda till en Doppler flödeshastigheten förhållandet mellan höger och vänster halspulsådern (RC / LC) av 5-10 (Figur 1). Jämfört med falsk drivs möss (Figur 2A), är möss med övertryck förväntas utvecklas hjärthypertrofi inom 1-2 veckor, och hjärtdilateringen efter 6-8 veckor, beroende på täthet sammandragning (Figur 2B). Dödlighet under den första månaden efter TAC är typiskt låg (<20%) i vildtyp möss, även genetiskt modifierade möss kan uppvisa olika överlevnad. 6,7
Figur 1. Bekräftelse av tvärgående Aorta Ligation med Doppler Velocity värdering. Representant Doppler hastighet signaler höger (RC) och vänster halspulsådern (LC) artärer 6 dagar efter TAC. Dessa inspelningar visar en lyckad ligation med en RC / LC flöde förhållandet ~ 6,8. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Figur 2. Representant hela hjärtat Images Efter TAC. A. Sham drivna vildtyp mus hjärta. B. Vildtyp mus hjärta 16 veckor efter TAC. Varje linje = 1mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAC, som härmar mänsklig aortastenos, är en vanlig metod för att framkalla hjärthypertrofi och hjärtsvikt hos möss. Alternativa platser för aorta förträngningar inkluderar stigande och bukaorta. Stigande aorta sammandragning ger en extrem och snabbare överbelastning på vänster kammare (LV). Däremot lämnar bukaortaaneurysm sammandragning intakt en större del av cirkulation som ett medel för eventuell ersättning. 8 Därför är TAC ofta den föredragna modellen som den ger tillräcklig LV överbelastning i ett tidsberoende sätt bättre lämpad för utredning. Även om detta förfarande kan vara tekniskt utmanande, med praktik, har vi uppnått en överlevnad på 80-90% i vildtyp möss.
Tätheten på tvärskepps aorta sammandragning avgör graden av hypertrofi utveckling och tidsram inom vilken hjärtsvikt och dilatation utvecklas. Dessutom påverkar ålder möss återvinningsgraden och kinetik av hjärtsvikt utveckling. Äldre möss (> 12 månader) tar längre tid att utveckla en adaptiv respons av halspulsåder till TAC, och kommer sannolikt att utveckla dilaterad kardiomyopati snabbare än yngre möss (3-4 månader). 5
Icke-invasiv intubation av möss tar lite övning. En alternativ metod är följande:
- En liten mittlinjen livmoderhalscancer snitt görs med trubbig sax och vävnaden separeras runt luftstrupen med hjälp av böjda pincett för att exponera luftstrupen.
- En bit av sutur placeras runt framtänderna och försiktigt dras bort från djurets kropp att förlänga nacken.
- Använda böjd pincett i ena handen, är tungan försiktigt manipulerade åt sidan.
- Med den andra sidan är endotrakeal intubation utförs med hjälp av PE 90 slang avfasade på kanten för att underlätta inträde.
Den endotrakealtub kopplas sedan till en Harvard volym-cyklade gnagare ventilator cykla på 125-150 andetag / minut och en tidalvolym på 0,1-0.3ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW är en WM Keck stiftelsen Unga framstående forskare inom medicinsk forskning, och stöds också av NIH / NHLBI bidrag R01-HL089598 och R01-R01HL091947 och muskeldystrofi Association bevilja # 69.238. RJvO är mottagare av 2008-2010 American Physiological Society postdoktorsstipendium i fysiologiska Genomics. Detta arbete stöds också delvis av Fondation Leducq alliansen för CaMKII signalering i Heart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
