Demostrar la utilidad de la citometría de flujo multicolor para la caracterización detallada fenotípica y funcional de la total, así como la memoria subconjuntos de células CD4 + y CD8 + T en macacos rhesus, el modelo ideal para estudios de vacunas contra el VIH / SIDA.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus
En este artículo
Resumen
Resumen
El modelo de macaco rhesus es actualmente el mejor modelo disponible para el VIH-SIDA con respecto a la comprensión de la patogénesis, así como para el desarrollo de vacunas y terapias
Protocolo
Los procedimientos para el análisis detallado fenotípica y funcional de la total, así como subconjuntos de células T de memoria se puede dividir en cuatro partes: 1) la preparación celular y la estimulación antigénica, 2) tinción de la superficie marcador, 3) tinción intracelular de citoquinas y 4) La citometría de flujo análisis.
1. Preparación de células y la estimulación antigénica
- Ambos recién aisladas, así como la crio-preservado las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se utilizaron en este protocolo. El PBMC fueron aisladas de muestras de sangre venosa heparinizada o con citrato de macacos rhesus por sedimen....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Dr. Pramod Nehete y la señora Bharti Nehete de sangre y muestras de PBMC macacos; Este trabajo fue financiado parcialmente con fondos del NIH AI 46969, y todos los medios de cultivo celular fueron producidos por el Laboratorio Central de los medios de comunicación, que es financiado por el NIH subvención CA 16672.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
Solución y Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 (Hyclone Laboratories, Logan, UT)
- Suero fetal bovino (FBS), (Hyclone Laboratories, Logan, UT)
- L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Penicilina / estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA)
- El azul tripán reactivo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, pH 8,6; filtrar y almacenar a 4 ° C
- Dulbecco PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free, Life Technologies, Rockville, MD)
- Flujo de tampón de lavado: suplementos DPBS con FBS al 2%, se almacenan a 4 ° C
- BD Cytofix / Cytoperm fijación / permeabilización solución Kit (BD Biosciences, San Jose, CA)
Agentes de la activación
- Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Coestimuladoras AcM CD49d, clon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA)
- Purificado por afinidad del anticuerpo F (ab ') 2 fragmentos de cabra anti-ratón IgG (H + L) (Kierkegaard y Perry laboratorio, Gaithersburg, MD)
- Agentes específicos de activación podría incluir piscinas péptido, solo péptido o proteína entera
Inhibidores de la secreción de citoquinas
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Plug Golgi se puede utilizar como alternativa (BD Biosciences, San Jose, CA)
Anticuerpos
- Live / Dead corregibles aqua fluorescentes kit de tinción (Invitrogen, Carlsbad, CA)
- PE-CD3 Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- CD4 Pacific Blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- CD28-PerCP Cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA)
Referencias
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Viru....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
