Realización y procesamiento de la PAAF de almohadilla grasa anterior de amiloide

Resumen

Aspiración de la almohadilla de grasa es un método preferido, el costo mínimamente invasiva, y baja en comparación con otros métodos para detectar amiloide para el diagnóstico de la amiloidosis sistémica. Este artículo vídeo muestra una descripción de los procedimientos para la realización de la aspiración almohadilla de grasa con el procesamiento adecuado de la muestra para el diagnóstico de los resultados óptimos.

Resumen

Históricamente, las biopsias de corazón, el hígado y el riñón se han realizado para demostrar los depósitos de amiloide en la amiloidosis. Desde la presentación clínica de esta enfermedad es muy variable y no específicos, los riesgos asociados de estas biopsias son demasiado grandes para el rendimiento diagnóstico. Otros sitios que tienen un menor riesgo de la biopsia, como la piel o gingival, son también relativamente invasivo y costoso. Además, estas biopsias no siempre pueden tener depósitos de amiloide suficiente para establecer un diagnóstico. Aspiración de la almohadilla de grasa ha demostrado una buena correlación clínica con un bajo costo y mínima morbilidad. Sin embargo, no existen protocolos estandarizados para la realización de este procedimiento o de procesamiento de la muestra de aspirado, lo que conduce a resultados variables y no reproducibles. La modalidad más utilizada para la detección de amiloide en los tejidos es una birrefringencia verde manzana en el Congo secciones teñidas de rojo con un microscopio de polarización. Esta técnica requiere una preparación de células bloque de material aspirado. Desafortunadamente, los pacientes que presentan en las primeras etapas de la amiloidosis tienen cantidades mínimas de amiloide, que reduce enormemente la sensibilidad del Congo teñidas de rojo las secciones bloque de celdas de aspirados almohadilla de grasa. Por lo tanto, la evaluación ultraestructural de aspirados almohadilla de grasa por microscopía electrónica debe ser utilizada, dada su mayor sensibilidad para la detección de amiloide. En este artículo se muestra un procedimiento simple y reproducible para la realización de la aspiración anterior almohadilla de grasa para la detección de amiloide, utilizando tanto la tinción con rojo de las secciones de bloque de celdas y la microscopia electrónica para la identificación ultraestructural.

Protocolo

Introducción

Amiloidosis sistémica es una enfermedad muy variable que hace referencia el depósito extracelular de proteínas diferentes que se conocen colectivamente como amiloide. La deposición de estas fibrillas de amiloide con la configuración plegada beta conduce a diferentes presentaciones clínicas en función de los órganos implicados. Las manifestaciones clínicas más relevantes de la amiloidosis sistémica se observan cuando hay participación de los órganos críticos como el corazón, el hígado y / o renal. Históricamente, estos órganos que se realizará una biopsia para demostrar la presencia de amiloide. Estos procedimientos moderadamente invasivos implicaba un riesgo importante, incluida la hemorragia. Aspiración de la almohadilla de grasa ha demostrado proporcionar un método confiable y no invasivo para la detección de amiloide en la amiloidosis sistémica ^1. Este procedimiento es básicamente similar a la liposucción de la grasa subcutánea en la pared anterior del abdomen con anestesia local para recuperar el tejido fibroadiposo para la evaluación de los depósitos de amiloide en la escasa pequeñas paredes de los vasos sanguíneos ^2.

El método más frecuentemente utilizado para la identificación de amiloide en el tejido sigue siendo la característica de manzana verde que se ve cuando birrefringencia Congo secciones teñidas de rojo se visualizan con un microscopio de luz polarizada ^3. Cuando la aspiración almohadilla de grasa se lleva a cabo, Congo manchas rojas se puede hacer en cualquiera de diapositivas directamente manchado o preparaciones de células bloque del tejido adiposo aspirado. Sin embargo, los pacientes en las primeras etapas de la amiloidosis tienen depósitos de amiloide escasa, lo que reduce enormemente la sensibilidad del Congo teñidas de rojo las secciones bloque de celdas ^4,5. Evaluación ultraestructural de aspirados almohadilla de grasa por microscopía electrónica tiene una mejor reproducibilidad y la mejora de la sensibilidad ^4. Por lo tanto, se recomienda a presentar todos los aspirados de la almohadilla de grasa, tanto para la preparación de un bloque de celdas y para la realización de microscopía electrónica ^2.

Aspiración de la almohadilla de grasa es un costo relativamente bajo y método no invasivo para la obtención de tejido para el diagnóstico de la amiloidosis sistémica. En este artículo se describe el procedimiento de aspiración de grasa almohadilla junto con detalles sobre el procesamiento de muestras para enviar muestras, tanto para la tinción con rojo y la evaluación ultraestructural por microscopía electrónica. En este vídeo, se demuestra este procedimiento reproducible y fácil de recuperar el material de diagnóstico óptimo.

1. Realización de la PAAF de la almohadilla de grasa anterior

A. anestesia de la zona (Figura 1 y 2)

1. Utilizando hisopos con alcohol o el agente de limpieza de la piel preferidos por una institución en particular, limpiar la piel en el área del cuadrante inferior del abdomen lateral a la línea media y por debajo del ombligo (Figura 1).
2. Marcar un área con forma de rombo de aproximadamente 2 x 2 pulgadas, como se muestra en la Figura 1, con un marcador.
3. Aspirar a unos 10 ml de lidocaína al 1% con una aguja 18G. Adjunte una aguja 25G de 1 ½ pulgadas de la jeringa. Eliminar el aire atrapado tocando la jeringa en posición vertical mientras se presiona el émbolo hasta que el líquido se dispensa y no hay burbujas de aire.
4. Anestesiar a lo largo de las fronteras de la zona ya marcada rombo, como se muestra en la Figura 2. Para empezar, la inserción de la aguja 25G debajo de la piel en el punto A y empuje con cuidado la aguja por vía subcutánea a punto X. Tire del émbolo de la jeringa para asegurarse de que no están dentro de un recipiente. A continuación, presione lentamente el émbolo para infiltrarse hasta 2,5 ml de lidocaína (alrededor de ¼ de la lidocaína en una jeringa de 10 ml) mientras se retira la aguja hasta el punto A, sin dejar la aguja sale de la piel en el punto A (figura 2a3). Con la aguja bajo la piel cambiar la dirección hacia el punto Y (figura 2a4) e introduzca la aguja por vía subcutánea a punto de Y (Figura 2b1). Al igual que antes, confirmar que la aguja no está en un recipiente y vierta aproximadamente 2,5 ml de lidocaína, mientras que poco a poco de retirar la aguja por el punto A. (Figura 2b3 través 2B4) Repita los pasos similares a partir del punto B y dispensación de lidocaína subcutánea de los puntos B y B a X a Y (Figura 2C1 través de 2d4). Evitar el sangrado en el aguijón A y B mediante la aplicación firme de la pieza de calibre estéril.
5. Ahora puede comprobar que la zona está anestesiada por tocar ligeramente la piel dentro del rombo anestesiados por la punta / rincón de la pieza de gasa de algodón, por comparación con la piel sin anestesia adyacentes.

B. Realizar la aspiración almohadilla de grasa (Figura 3)

(La aplicación de anestesia local antes de la ejecución de la aspiración de la almohadilla de grasa puede ser evitada, dependiendo de las preferencias regionales e individuales. Procedimiento correctamente realizado PAAF para la aspiración anterior almohadilla de grasa se puede completar en un pinchazo. Sin embargo, dependiendo del umbral de dolor de cada paciente , las maniobras de la aguja 18G de ida y vuelta en el tejido adiposo subcutáneo es relativamente distrescantar. El método descrito aquí anestesia para lograr el efecto en sólo dos pinchazos con una aguja 25G y evita el dolor con una mejor tolerancia al procedimiento.)

1. Ensamble 18G 1 ½ pulgadas de aguja en una jeringa de 10 ml. Monte el conjunto de jeringa con aguja en las garras de la jeringa ("agarre PAAF / pistola") para su correcta aplicación y liberación de vacío.
2. Inserte la punta de la aguja en la grasa subcutánea en el área romboidal limpia y anestesiados (Figura 3a).
3. Retraiga completamente el émbolo de la jeringa con la aguja que se inserta en el tejido subcutáneo para generar vacío (Figura 3b).
4. Mantener el vacío y la maniobra de la aguja hacia atrás y adelante en varias direcciones en la grasa subcutánea (Figura 3c a través de 3i). Cada golpe debe ser el mayor tiempo posible con la longitud de la aguja seleccionados sin dejar la aguja sale de la piel. Máximo de muestreo se logra cambiando de dirección con cada golpe (Figura 3i). Es importante mantener la dirección de la aguja tangencial a la serosa y en paralelo a la superficie de la piel para evitar la punción de la cavidad peritoneal.
5. El tejido fibroadiposo se acumula en la jeringa. Fragmentos de una vez suficiente tejido fibroadiposo (hasta 1 ml de muestra de fragmentos de sangre mezclada ricos) se recuperan, liberar el vacío y extraiga la aguja (Figura 3K).
6. Que el paciente o el asistente de aplicar una presión firme en el ámbito del procedimiento con una almohadilla de gasa para evitar la extravasación de sangre.

2. Procesamiento de muestras

1. Lugar por lo menos 5-6 fragmentos de tejido fibroadiposo en solución de glutaraldehído para microscopía electrónica (fig. 4B).
2. Dependiendo del protocolo institucional, un frotis de algunos de los fragmentos de tejido fibroadiposo se puede preparar mediante la difusión de ellas entre dos diapositivas (Figura 4).
3. El material restante se deja coagular en la jeringa (puede tardar 5-7 minutos, dependiendo del tiempo de coagulación) (Figura 4 C).
4. Aspirar formalina al 10% en la jeringa para que el material del tejido fibroadiposo coagulada se desprendió de la pared de la jeringa y la libre flotación (Figura 4C2). Retire el émbolo de la jeringa (Figura 4C3) y transferir el tejido fibroadiposo coagulada en el recipiente de formol al 10% desde el extremo abierto de la jeringa frente al extremo de la boquilla (Figura 4C4).
5. Etiqueta de los envases debidamente y presentar el glutaraldehído para microscopía electrónica y el formol para H & E y la sección de Congo mancha roja de evaluación en el marco de polarización microscopía. Si las manchas están preparados, pueden ser procesados ​​de acuerdo con el protocolo de cada laboratorio.

Figura 1. El área a ser anestesiado por PAAF de la almohadilla de grasa anterior.

Figura 2. Anestesia de la zona.

Figura 3. Realizar PAAF de la almohadilla de grasa anterior.

Figura 4. Procesamiento de la almohadilla de grasa anterior aspirar a ser presentada al laboratorio para la detección de depósitos de amiloide.

3. Resultados representante

Figura 5. Amiloides en la pared de los vasos sanguíneos pequeños en los fragmentos de tejido fibroadiposo. Tejido fibroadiposo fue procesado en formol, embebidos en parafina, se tiñeron con rojo congo, y examinadas por microscopía óptica de polarización. Amiloides en la pared de los vasos sanguíneos pequeños muestra birrefringencia verde manzana (flecha blanca).

Figura 6. Los tejidos que carecen de la amiloidosis. La birrefringencia verde manzana está ausente en los tejidos de un paciente diferente sin amiloidosis. Birrefringencia azul (flecha blanca) de las fibras de colágeno, suelen estar presentes en casi todas las muestras.

Figura 7. Fibrillas de amiloide en consonancia con la pared del vaso sanguíneo. Micrografía electrónica de recto, sin ramificaciones, esparcidas al azar 8-10 fibrillas nm de diámetro formado por amiloide en la pared del vaso sanguíneo.

Discusión

El diagnóstico de amiloidosis se logra generalmente con una biopsia de tejido de los órganos afectados, como el riñón, el hígado y / o del corazón. Este enfoque ha resultado del diagnóstico de alta, sin embargo, es invasivo y puede estar asociada con complicaciones como la hemorragia ^2. Rectal, gingival y biopsias de médula ósea se prefiere para el diagnóstico como el enfoque relativamente menos invasivo en 1960 ^6,7,8. La aspiración de grasa abdominal se informó en el año 1973 como una caja fuerte, procedimiento mínimamente invasivo y sencillo, y menos costoso para el diagnóstico del tejido de la amiloidosis sistémica ^1. Sin embargo, los detalles del procedimiento y el enfoque de procesamiento de la muestra recuperada no es coherente informó. Este vídeo y el artículo describe el procedimiento paso a paso.

El enfoque para la detección de amiloide en la aspiración de la almohadilla de grasa, de manera similar, tampoco es bien estandarizados con unos pocos estudios comparar y evaluar los distintos enfoques ^1,5,6,7,8. Evaluación de la anterior aspirados almohadilla de grasa con la tinción con rojo es menos sensible a la reproducibilidad interobservador baja, especialmente en los primeros casos de amiloidosis con depósitos de amiloide escasos ^5. La inmunohistoquímica realizada en formol fija bloque de parafina de células secciones y Congo fluorescencia roja realizada en frotis citológico se han reportado para mejorar la sensibilidad diagnóstica de ^9,10. La microscopía electrónica mejora la detección e identificación de las fibrillas de amiloide escaso en las pequeñas paredes de los vasos sanguíneos en el tejido fibroadiposo de la grasa aspira el parche ^{4, 5.} Con base en esta información, este artículo se describe el procesamiento de la muestra para preparar los bloques de celdas (para la evaluación de rojo Congo secciones teñidas con bloque de celdas bajo el microscopio de polarización para el diagnóstico de manzana birrefringencia verde y también para la inmunohistoquímica, como se indica) y por microscopía electrónica. Sin embargo, dependiendo de la opción elegida para la evaluación de la muestra para el amiloide, que puede ser sometido a la preparación de muestra para citología, la preparación de bloques de células, y el procesamiento para microscopía electrónica. Algunos laboratorios realizan las pruebas en los frotis preparados a partir de los fragmentos de tejido fibroadiposo aspirado y se tiñen con rojo Congo para estudiar la fluorescencia ^10.

En general, en una amiloidosis tarde, el microscopio de luz con microscopía de rojo Congo polarización puede ser suficiente, sin embargo, en las primeras etapas de la enfermedad de las manchas de rojo Congo con microscopio de polarización en las secciones de bloque de celdas es menos sensible y fiable de la grasa aspirados pad ^4,5,11 . Otras tinciones especiales como thioflavin T se puede utilizar con las mismas limitaciones. Otros enfoques para la detección de amiloide incluir la evaluación de los frotis de aspirado de amiloide con Congo microscopía de fluorescencia de color rojo polarizado y ^10. En nuestra experiencia, este método es menos reproducible. Evaluación de los vasos sanguíneos en la almohadilla de grasa de amiloide mediante microscopía electrónica supera estas limitaciones ^4,11. Además de la caracterización de amiloide ha sido reportado por inmunomicroscopía ^12, sin embargo, estos métodos pueden no estar disponibles ampliamente en un centro de atención no terciaria.

Las agujas utilizadas para la realización de procedimientos de aspiración se pueden clasificar según su tamaño calibre en finas (21-25G), intermedio (18-20G) y grandes (por ejemplo-14G) ^11. Anterior aspiraciones almohadilla de grasa se ​​ha informado que se realiza mediante el uso de indicadores de variables que van desde la intermedia (18 a 20G) de multa (21 a 22G) ^2,10. La mayoría de las lesiones tumorales son aspirados con agujas de calibre fino (por ejemplo, 25G) para obtener un buen frotis citológico, junto con pases adicionales con aguja de calibre amplio (por ejemplo, 18G) para recuperar muestras adicionales de los bloques de celdas.

Durante la aspiración anterior almohadilla de grasa, el tejido fibroadiposo cohesionada no aspirar así con las agujas más finas. Preparación bloque de celdas y la microscopía electrónica son importantes para la evaluación de las pequeñas paredes de los vasos sanguíneos en los fragmentos de tejido fibroadiposo en el aspirado de grasa. Agujas de calibre amplio (por ejemplo, 18G) se recomiendan para obtener material diagnóstico adecuado ^2,10. Como el procedimiento es comparable a la PAAF convencionales, la aspiración de la almohadilla de grasa que se conoce como la PAAF, aunque en general agujas de calibre puede ser utilizado para la realización de un ^5.

Materiales

Torundas con alcohol, gasa, marcador, jeringas de 10 ml x 2, 1% de lidocaína (anestésico local, lidocaína Si se utiliza solo, se produce una sensación de ardor inicial después de la instilación. Esto se puede prevenir mediante el uso de una mezcla de 1:1 de 1% lidocaína y el 1% de sodio-bi-carbonato), calibre 18 (G) 1 ½ pulgadas de agujas x2 (para la realización de PAAF), 25G 1 ½ pulgadas de agujas (para inyectar un anestésico local), titular de la FNA jeringa ("pistola"), venda, vial de glutaraldehído (por microscopía electrónica), y el contenedor de la biopsia de formol al 10%.