Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.
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Artículo de método
Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones
En este artículo
Resumen
Resumen
El ser humano gastrointestinal (GI) es un entorno único en el que las células epiteliales intestinales y no patógenas (comensales), las bacterias conviven. Se ha propuesto que el microambiente que el patógeno se encuentra en la capa de comensales es importante para determinar la extensión de la colonización. Los métodos actuales de cultivo para la investigación de la colonización de patógenos no son muy adecuadas para la investigación de esta hipótesis, ya que no permiten el co-cultivo de bacterias y células epiteliales de una forma que imita el microambiente del tracto gastrointestinal. Aquí se describe un co-cultivo de microfluidos modelo que permite a la cultura independiente de las células eucariotas y las bacterias, y probar el efecto del microambiente comensales en la colonización de patógenos. El modelo de co-cultivo se demuestra mediante el desarrollo de un comensal
Protocolo
1. Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía 1 (no se muestra en este video).
- El uso estándar de SU-8 métodos de fotolitografía para crear un SU-8 "maestros" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) para la fabricación de los diferentes componentes (PDMS de diferente grosor, el co-cultivo de la cámara) en una sala limpia. Moldes como maestro se pueden fabricar en cualquier centro de microfabricación (por ejemplo, Stanford microfluídica de fundición; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Antes de la replicación PDMS, exponer el SU-8 maestros a fluo....
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Discusión
Ensayos convencionales para la fijación y la colonización de patógenos utilizar una monocapa de células eucariotas en placas de cultivo de tejido en el que los agentes patógenos se agregan. Estos modelos no son fisiológicamente relevantes, ya que no incorporan un biofilm de bacterias comensales desarrollado en las células eucariotas. Simple adición de un cultivo de bacterias pre-convertido en células eucariotas es improbable que lleve a esta conformación, como los biofilms son muy organizadas las estructuras que se desa.......
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0846453) y los Institutos Nacionales de Salud (1R01GM089999).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| máscara de fotolitografía de alta resolución (16.256 ppp) | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Tricloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctil)silano | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| centrífuga programable | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| alineador de máscara | Neurotronix | Q4000 | |
| grabador de plasma de oxígeno | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| bomba de jeringa | Harvard Apparatus | ||
| Kit de viabilidad/citotoxicidad Live/Dead | Invitrogen | L-3224 |
Referencias
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves....
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Reimpresiones y permisos
