Los autores no tienen nada que revelar.

christopher hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (entrevista)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes CW describe la utilidad de su sistema de cultivo para el estudio de la angiogénesis in vitro. Explica la importancia de los fibroblastos que secretan una crítica, aún no identificado, el factor soluble que permiten a las células endoteliales para formar los vasos en la cultura que se ramifican, forma lúmenes adecuada, y se someten a anastomosis.

Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describe la utilidad de su sistema de cultivo para estudiar la angiogénesis in vitro. Explica la importancia de los fibroblastos que...

Hola, mi nombre es el Dr. Christopher Hughes. Soy profesor en la Universidad de California en Irvine, y mi laboratorio trabaja en angiogénesis. En particular, estamos interesados en los genes que regulan el proceso de angiogénesis.Hemos optimizado un ensayo in vitro basado en el trabajo de Nelson y, en este ensayo, podemos observar todos los diferentes procesos que ocurren durante la angiogénesis. Recubrimos microesferas de dextrano, pequeñas esferas con células endoteliales. Luego las incorporamos en geles de fibrina. Proporcionamos factores de crecimiento.Y durante varios días, las células endoteliales brotan de las microesferas. Migran, se alinean, proliferan, forman tubos, se ramifican y crean anastomosis. De modo que alrededor del día 10 tenemos una red capilar completa en cultivo.Bueno, algunos de los problemas con los ensayos *in vivo* y de angiogénesis, por ejemplo, aquellos que se realizan en ratones, es que es mucho más difícil manipular el sistema. Es complicado visualizar lo que ocurre dentro de un animal; no se puede ver realmente la angiogénesis en curso. Y si se desea manipular el sistema en nuestros cultivos *in vitro*, es muy sencillo manipular genéticamente las células endoteliales, activar genes o desactivarlos, y observar los efectos de ello sobre la angiogénesis por brotamiento.Y es mucho más difícil hacerlo en un animal completo. Es necesario crear knockouts o knockins. Esas son las dos ventajas principales.Es fácil de manipular y fácil de visualizar. Por lo tanto, a lo largo de los años, se han desarrollado varios ensayos in vitro de angiogénesis diferentes, cada uno con sus ventajas y desventajas. En particular, uno ampliamente conocido es el ensayo con gel de matriz, en el que las células endoteliales se colocan sobre una matriz extracelular denominada matrigel.Y el problema allí es que las células endoteliales forman estructuras similares a cordones, pero nunca llegan a formar verdaderos vasos con luz definida. No se observa brotamiento ni anastomosis. Existen modelos de gel de colágeno, que pueden ser buenos.Hay muchos de esos en los que no se observa proliferación de las células endoteliales. Tampoco se tiende a observar anastomosis. El ensayo con gel de fibrina que hemos desarrollado se basa en un modelo de Nelson Kar publicado a mediados de los noventa.Y ahora hemos mejorado considerablemente esto, de modo que podemos observar todas las etapas de la angiogénesis. Podemos ver el brotamiento inicial, la migración. Observamos la proliferación de células, la formación de lumen, obtenemos ramificación y finalmente logramos la anastomosis para formar una red vascular completa in vitro.Por lo tanto, creemos que este ensayo es realmente el mejor sistema in vitro disponible si se desea observar todas esas diferentes etapas de la angiogénesis. Otra ventaja que tenemos con este ensayo in vitro es que podemos realizar captura láser y microdisección; podemos centrifugar el cultivo para que quede muy plano y luego utilizar el microscopio de microdisección con captura láser. De hecho, podemos extraer células individuales, y en particular estamos interesados en las células apicales.Y así estamos eliminando esas partes y podemos analizar la expresión génica, particularmente en las células del extremo frente a las células del tronco, las células que realmente están formando el lumen. Nuestra hipótesis es que habrá una expresión génica diferencial entre esas dos poblaciones celulares. Podemos examinar esto, lo cual sería prácticamente imposible de realizar en un sistema in vivo.Por lo tanto, creemos que esa es otra ventaja importante de utilizar este ensayo in vitro. El trabajo inicial que se realizó en este campo, como mencioné anteriormente por Nelson Recon, utilizó células endoteliales microvasculares. Y existe una gran corriente de pensamiento que considera que las células endoteliales microvasculares son las células que se deberían utilizar en un ensayo como este, porque in vivo son las EC microvasculares las que realmente forman nuevos vasos.Decidimos intentar hacer esto con ve. Estas son células endoteliales de vena umbilical humana por varias razones. Una de ellas es que estas células son muy fáciles de obtener.Puede ir al hospital, obtener cordones umbilicales de las salas de partos y aislar las células de manera muy sencilla. Además, estas células se han utilizado en cultivo durante muchos años. Están muy bien caracterizadas.Y así establecimos este ensayo y lo optimizamos para poder utilizar estas células por esas razones. Y curiosamente, resulta que las vex, estas células endoteliales de vasos grandes, parecen adoptar la forma de células endoteliales microvasculares en cultivo. Pierden muchos genes que normalmente son expresados por las ec de vasos grandes y comienzan a expresar genes que normalmente están asociados con células endoteliales microvasculares.Y son perfectamente capaces de formar brotes similares a capilares, de generar lúmenes y de producir estructuras que en conjunto se asemejan a capilares reales en cultivo. Por lo tanto, son fáciles de usar, fáciles de manipular, y realizan lo que deseamos que hagan. Brotan y forman vasos adecuadamente lumenizados.Cuando deseamos cuantificar este ensayo, existen realmente varias formas de hacerlo. Podemos examinar criterios verdaderamente cuantitativos, como el número de brotes, la longitud de los brotes, el diámetro de los brotes, el número de puntos de ramificación y el número de anastomosis, pero también podemos considerar criterios cualitativos. Por ejemplo, podemos observar si están formando lúmenes.Y eso probablemente es lo que más nos interesa. En muchos de los ensayos que realizamos, es la formación adecuada del lumen. Y esto es realmente más una evaluación cualitativa, aunque a medida que los vasos aumentan de tamaño, también se puede medir el diámetro de esos lúmenes.Por lo tanto, utilizamos fibroblastos en estos cultivos. Incrustamos las microesferas en el gel de fibrina y sembramos fibroblastos encima del gel. Los fibroblastos son absolutamente esenciales para una brotación adecuada y la formación de lumen.En ausencia de fibroblastos, se observa cierto brote. Sin embargo, las células endoteliales tienden a no permanecer unidas entre sí. Lo que ocurre es que migran separándose unas de otras.Y así, cualquier estructura que se desarrolle en este brote tiende a desintegrarse. Y después de unos días, las células endoteliales sufren apoptosis. Por lo tanto, parece que los fibroblastos producen factores esenciales para la angiogénesis, al menos en este sistema in vitro.Y hemos estado muy interesados en conocer cuáles son esos factores. Lo que hemos descubierto es que los fibroblastos secretan algo al medio, de modo que podemos tomar el medio condicionado de los fibroblastos y este será capaz de favorecer una brotación adecuada y la formación de lumen. Por lo tanto, definitivamente estamos ante un factor soluble.Es evidente que estamos muy interesados en saber qué es lo que están produciendo los fibroblastos que resulta tan importante para la angiogénesis en este sistema. Hemos probado todos los factores habituales: VEGF, FGF básico, están en el cultivo, pero añadir más no sustituye a los fibroblastos. También hemos probado la angiopoietina 1, TGF beta, HGF, etcétera, etcétera.Hasta ahora no hemos encontrado el factor vital. Por lo tanto, lo que estamos haciendo ahora es purificar factores del medio condicionado de fibroblastos. Así, estamos pasando el medio condicionado por diversas columnas, de intercambio catiónico, de exclusión por tamaño, y estamos obteniendo fracciones que presentan actividad.Y ahora estamos siguiendo esa actividad y tomando esas fracciones, identificando cuáles son activas, y a partir de ahí podemos correrlas en geles, asegurarnos de que tenemos solo unas pocas bandas en el gel y luego podemos cortarlas y obtener sus secuencias mediante espectrometría de masas. Y eso nos está proporcionando días muy interesantes. Actualmente contamos con varios genes candidatos que estamos probando individualmente para ver si son realmente el factor que estamos buscando.Por lo tanto, hemos probado muchos factores angiogénicos conocidos y sabemos que el VEGF y el FGF básico son esenciales para la brotación adecuada en este ensayo. Pero eso no lo es todo. Existen factores derivados que son importantes, como mencioné, y una forma en que hemos estudiado esto es utilizando células tumorales, que son altamente angiogénicas in vivo, generan tumores grandes en ratones y están altamente vascularizadas.Y hemos analizado estas células tumorales y expresan niveles muy altos de VEGF, y las hemos introducido en nuestros cultivos. Por lo tanto, hemos sustituido los fibroblastos por estas células tumorales, y no promueven una angiogénesis robusta en este ensayo. Y eso es muy interesante.Lo que esto sugiere, y que también ha sido sugerido por otras personas, es que existe una comunicación cruzada entre el tumor, el estroma, que son los fibroblastos y otras células de soporte en el tejido, y las células endoteliales. Es muy probable que las células tumorales produzcan algunos factores que actúan directamente sobre las células endoteliales, pero también producen otros que estimulan a los fibroblastos y a otras células estromales para que generen factores que asimismo favorezcan una angiogénesis robusta.

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Biología

University of California, Irvine (UCI).  Christopher Hughes CW describe la utilidad de su sistema de cultivo para el estudio de la angiogénesis in vitro. Explica la importancia de los fibroblastos que secretan una crítica, aún no identificado, el factor soluble que permiten a las células endoteliales para formar los vasos en la cultura que se ramifican, forma lúmenes adecuada, y se someten a anastomosis.

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