Los autores no tienen nada que revelar.

christopher hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (entrevista)

Christopher Hughes CW describe la utilidad de su sistema de cultivo para el estudio de la angiogénesis in vitro. Explica la importancia de los fibroblastos que secretan una crítica, aún no identificado, el factor soluble que permiten a las células endoteliales para formar los vasos en la cultura que se ramifican, forma lúmenes adecuada, y se someten a anastomosis.

Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Hola, mi nombre es Dr. Christopher Hughes. Soy profesor en la Universidad de California en Irvine, y mi laboratorio trabaja en la angiogénesis. Y estamos particularmente interesados en los genes que regulan el proceso de angiogénesis.Hemos optimizado un ensayo in vitro basado en el trabajo de Nelson y, en este ensayo, podemos observar todos los diferentes procesos que ocurren durante la angiogénesis, recubrimos perlas tedex, pequeñas perlas con células endoteliales. A continuación, los incrustamos en geles de fibrina. Proporcionamos factores de crecimiento.Y en el transcurso de varios días, las células endoteliales brotan de las perlas. Migran, se alinean, proliferan, forman tubos, se ramifican y forman anastomosis. De modo que a los 10 días tenemos una red capilar completa en cultivo.Bueno, algunos de los problemas con los ensayos de envivo y angiogénesis, por ejemplo, los que se hacen en ratones, es que no es muy fácil manipular el sistema. Es difícil visualizar cuando tienes esto sucediendo dentro de un animal, realmente no puedes ver la angiogénesis sucediendo. Y si quieres manipular el sistema en nuestros cultivos in vitro, es muy fácil manipular genéticamente las células endoteliales, activar y desactivar los genes, y observar los efectos de eso en la angiogénesis germinante.Y es mucho más difícil hacer eso en todo el animal. Tienes que hacer nocauts o knockins. Esas son las dos principales ventajas.Es fácil de manipular y es fácil de visualizar. Entonces, a lo largo de los años, se han desarrollado varios ensayos de agenesia in vitro diferentes y todos tienen sus ventajas y desventajas. Y, en particular, uno muy conocido es el ensayo de gel de matriz, donde las células endoteliales se colocan encima de esta matriz extracelular llamada matrigel.Y el problema es que las células endoteliales forman estructuras parecidas a cordones, pero nunca hacen vasos aluminizados adecuados. No se ve brotar, no se ve anastomosis. Hay modelos de gel de colágeno, que pueden ser buenos.Hay muchos de los que no se ve la proliferación de las células endoteliales. No se tiende a ver anastomosis. El ensayo de gel de fibrina que hemos desarrollado está basado en un modelo de Nelson Kar publicado a mediados de los años noventa.Y ahora hemos mejorado drásticamente eso, de tal manera que podemos ver todas las etapas de la angiogénesis. Podemos observar el brote inicial, la migración. Vemos proliferación de células, vemos formación de lúmenes, conseguimos ramificaciones y, finalmente, conseguimos que la anastomosis forme una red vascular completa in vitro.Por lo tanto, creemos que este ensayo es realmente el mejor sistema in vitro que existe si se desea observar todas esas diferentes etapas de la angiogénesis. Otra ventaja que tenemos con este ensayo in vitro es que podemos hacer captura láser, microdisección, podemos girar el cultivo para que quede muy plano, y luego usar el microscopio de microdisección de captura láser. De hecho, podemos extraer células individuales y, en particular, estamos interesados en las células de punta.Y por lo tanto, los estamos eliminando y podemos observar la expresión génica, particularmente en las células de la punta frente a las células del tronco, las células que realmente están produciendo el lumen. Y nuestra hipótesis es que habrá una expresión génica diferencial entre esas dos poblaciones de células. Podemos ver eso, sería prácticamente imposible hacer eso en un sistema in vivo.Así que creemos que esa es otra gran ventaja de usar este ensayo in vitro. Los primeros trabajos que se hicieron en esto, como mencioné de Nelson Recon, utilizaron células endoteliales microvasculares. Y se piensa mucho que las células endoteliales microvasculares, las células que se querrían usar para un ensayo como este, porque in vivo, es la CE microvascular la que realmente está formando nuevos vasos.Decidimos intentar hacer esto con ve. Estas son células endoteliales de la vena umbilical humana por un par de razones. Una de ellas es que estas células son muy fáciles de obtener.Puede ir al hospital, puede obtener cordones umbilicales de las salas de parto y puede aislar las células muy fácilmente. Y también estas células se han utilizado en cultivo durante muchos años. Están muy bien caracterizados.Así que configuramos este ensayo y lo optimizamos para que pudiéramos usar estas celdas por esas razones. Y curiosamente, resulta que vex, estas células endoteliales de grandes vasos parecen tomar la forma de células endoteliales microvasculares y cultivo. Pierden una gran cantidad de genes que normalmente se expresan por la ec de grandes vasos y comienzan a expresar genes que normalmente se asocian con las células endoteliales microvasculares.Y son perfectamente capaces de formar capilares como brotes, de producir lúmenes y hacer lo que todo el mundo parecen capilares reales en cultivo. Por lo tanto, son fáciles de usar, son fáciles de usar y hacen lo que queremos que hagan. Brotan y hacen vasos aluminizados adecuados.Cuando queremos cuantificar este ensayo, realmente hay un par de formas que podemos seguir. Podemos fijarnos en criterios realmente cuantitativos como el número de brotes, la longitud de los brotes, el diámetro de los brotes, el número de puntos de ramificación, el número de anastomosis, pero también nos fijamos en criterios cualitativos. Y así podemos ver si están formando lúmenes.Y eso es probablemente lo que más nos interesa. En muchos de los ensayos que hacemos es su correcta formación de lúmenes. Y eso es realmente una evaluación cualitativa, aunque a medida que los vasos se hacen más grandes, también se puede medir el diámetro de esos lúmenes.Por lo tanto, usamos fibroblastos en estos cultivos. Incrustamos las perlas en el gel de fibrina y colocamos fibroblastos sobre el gel. Los fibroblastos son absolutamente esenciales para la correcta brotación y formación de lúmenes.En ausencia de fibroblastos, obtenemos algunos brotes. Sin embargo, las células endoteliales tienden a no permanecer unidas entre sí. Lo que sucede es que migran unos de otros.Y así, cualquier estructura que estés desarrollando en este brote tiende a desmoronarse. Y después de unos días, las células endoteliales sufren apoptosis. Así que parece que los fibroblastos están produciendo un factor que es esencial para la angiogénesis, al menos en este sistema in vitro.Y hemos estado muy interesados en saber cuáles son esos factores. Lo que hemos encontrado es que los fibroblastos secretan algo en el medio, por lo que podemos tomar el medio de condición de los fibroblastos y eso apoyará la germinación adecuada y la formación de lúmenes. Así que definitivamente estamos lidiando con un factor soluble.Así que, obviamente, estamos muy interesados en saber qué es lo que producen los fibroblastos que es tan importante para la angiogénesis en este sistema. Hemos probado todos los sospechosos habituales, VEGF, fg F básico, están en el cultivo, agregar más no sustituye a los fibroblastos. También hemos probado angiopoyetina ona, TGF beta, H, GF, etcétera, etcétera.Hasta ahora no hemos encontrado el factor vital. Así que lo que estamos haciendo ahora es purificar los factores del medio de la condición de los fibroblastos. Así que estamos colocando la condición media sobre varias columnas, catión, intercambio, exclusión de tamaño, y estamos obteniendo fracciones de eso que tienen actividad.Y ahora estamos siguiendo esa actividad y estamos tomando esas fracciones, encontrando cuáles están activas, y a partir de ahí podemos ejecutarlas en geles, asegurarnos de que tenemos solo un número relativamente pequeño de bandas en el gel y luego podemos cortarlas y secuenciarlas por espectrometría de masas. Y eso nos está dando muchos días interesantes. Ahora tenemos bastantes genes candidatos que estamos probando individualmente para ver si realmente son el factor que estamos buscando.Por lo tanto, hemos probado muchos factores angiogénicos conocidos y sabemos que el GF vegetal y el FGF básico son realmente esenciales para la germinación adecuada en este ensayo. Pero no son toda la historia. Hay factores derivados que son importantes como, como mencioné, y una forma en que hemos visto esto es que hemos tomado células tumorales, que son altamente angiogénicas in vivo, generan tumores grandes en ratones y están altamente vascularizadas.Y hemos observado estas células tumorales y expresan niveles muy altos de VEGF y los hemos puesto en nuestros cultivos. Por lo tanto, hemos sustituido los fibroblastos con estas células tumorales y no admiten una angiogénesis robusta en este ensayo. Y eso, eso es muy interesante.Lo que eso sugiere, y esto también ha sido sugerido por otras personas, es que hay una diafonía entre el tumor, el estroma S, que son los fibroblastos y otras células de soporte en el tejido y las células endoteliales. Y bien puede ser que las células tumorales produzcan algunos factores que trabajen directamente sobre las células endoteliales, pero también produzcan otros que estimulen los fibroblastos y otras células estromales para producir factores que luego también apoyen una angiogénesis robusta.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

University of California, Irvine (UCI).  Christopher Hughes CW describe la utilidad de su sistema de cultivo para el estudio de la angiogénesis in vitro. Explica la importancia de los fibroblastos que secretan una crítica, aún no identificado, el factor soluble que permiten a las células endoteliales para formar los vasos en la cultura que se ramifican, forma lúmenes adecuada, y se someten a anastomosis.

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