Mamá es una única proteína magnetosomas asociados, que ha demostrado ser involucrados en la activación de magnetosomas. Aquí se presenta el protocolo de purificación de Mama supresión mutante (MamAΔ41) de M. magneticum AMB-1.
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Artículo de método
La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41
En este artículo
Resumen
Resumen
Las bacterias magnetotácticas comprenden un grupo heterogéneo de microorganismos acuáticos que son capaces de orientarse a lo largo de los campos geomagnéticos. Este comportamiento se cree para ayudar a su búsqueda de ambientes adecuados
Protocolo
1. Clonación y expresión de genes en E. mamá coli
El gen mutante mamAΔ41 se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico de Magnetospirillum magneticum AMB-1, con los cebadores: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'y 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. En los fragmentos de ADN amplificados, un sitio NcoI se introdujo en el codón de iniciación ATG y el codón de terminación fue sustituido por un sitio de SCOI. Los fragmentos fueron digeridos con NcoI y SacI y se clonó en los respectivos sitios de pET52b (+), dando lugar a pET52bMamAΔ41-AMB1. En esta construcción, el gen mamAΔ41
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Discusión
Purificación de proteínas es el paso principal en todas las proteínas bioquímicos o estudios estructurales. Dado que cada proteína es única con su propio comportamiento, es necesario definir sus propiedades y modificar en consecuencia su purificación. Blanco de la proteína debe ser analizado como un primer paso hacia la purificación usando herramientas bioinformáticas. Que se utilizan para calcular el objetivo de punto isoeléctrico, evaluar su necesidad de la reducción / oxidación medio ambiente y su necesidad de iones .......
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Agradecimientos
Reconocemos el Dr. Amir Aharoni por su apoyo y Geula Davidov, Grimberg Noam y Guttman Chen por sus consejos y comentarios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Prensa francesa | Equipo | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| Célula de presión | Equipo | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| Ultracentrífuga | Equipo | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| Rotor | Equipo | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| Tubos para ultracentrífuga; Botella de PC + tapa para ensayo de 26,3 ml | Equipo | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| Columnas cromatográficas de vidrio Econo-Column de 2,5 cm de diámetro | Equipo | Bio-Rad | 737-2521 | |
| Resina Ni-NTA His Bind | Equipo | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| Espectrofotómetro | Equipo | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| Cubeta de cuarzo | Equipo | Hellma | 104-QS | |
| Cromatografía líquida de alto rendimiento - AKTA purifier 10 | Equipo | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Columna de intercambio iónico – MonoQ 4,6/100 PE | Equipo | GE Healthcare | 10025543 | |
| Columna preempacada de exclusión por tamaño - HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipo | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10.000 MWCO | Equipo | Sartorius AG | VS1501 | |
| Centrífuga de mesa | Equipo | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipo | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hidroximetil) aminometano | Reactivo | BioLab | 20092391 | |
| Cloruro de sodio | Reactivo | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazol | Reactivo | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA | Reactivo | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnasa I (desoxirribonucleasa I) | Reactivo | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Trombina bovina | Reactivo | Fisher Scientific | BP25432 | |
| Glicina | Reactivo | BioLab | 07132391 | |
| Sodio dodecilsulfato (SDS) | Reactivo | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercapto–etanol | Reactivo | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | Reactivo | Expedeon | 1SB01L | |
| Escalera de proteínas preteñidas PageRuler | Reactivo | Fermentas | SM0671 |
Referencias
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D'Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F,
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Reimpresiones y permisos
