Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

Resumen

Este video muestra el protocolo de un ensayo de angiogénesis in vitro que recapitula varias etapas de la angiogénesis. Time-lapse imágenes de germinación, la formación del lumen, ramas y anastomosis - las características clave de la angiogénesis - se muestran.

Resumen

La angiogénesis es un complejo proceso de múltiples pasos, donde, en respuesta a estímulos angiogénicos, nuevos vasos son creados a partir de los vasos existentes. Estas medidas incluyen: la degradación de la membrana basal, proliferación y migración (brotes) de las células endoteliales (CE) en la matriz extracelular, la alineación de la CE en los cables, ramas, la formación del lumen, anastomosis y la formación de una nueva membrana basal. Muchos de los ensayos in vitro se han desarrollado para estudiar este proceso, pero la mayoría sólo imitar ciertas etapas de la angiogénesis, y morfológicamente los vasos en los ensayos a menudo no se parecen a los barcos en vivo. Basado en un trabajo anterior de Niels y Drenckhahn, hemos optimizado un ensayo de angiogénesis in vitro, que utiliza la vena umbilical humana CE y los fibroblastos. Este modelo recapitula todas las etapas clave al comienzo de la angiogénesis y, sobre todo, los vasos pantalla patente lúmenes intercelular rodeado de polarización CE. CE se aplica sobre microportadores cytodex y embebido en un gel de fibrina. Los fibroblastos son en capas en la parte superior del gel donde se presten los necesarios factores solubles que promueven la CE que brotan de la superficie de los granos. Después de varios días, numerosos vasos que están presentes se puede observar fácilmente en contraste de fases y microscopía lapso de tiempo. Este video muestra los pasos clave en la creación de estas culturas.

Protocolo

CÉLULAS PREPARACIÓN

1. Abrir HUVEC y fibroblastos en M199/10% de SFB / Pen-estreptococo (1:100) 1-2 días antes de abalorios.
2. Interruptor de medio EGM-2 (Clonetics) el día antes de abalorios para HUVEC y el día antes de la incrustación de los fibroblastos.
3. Una concentración de aproximadamente 400 bolas por HUVEC es necesario.
4. 20.000 fibroblastos por bien que se necesita.

RECUBRIMIENTO las cuentas con HUVEC - día -1

1. Trypsinize HUVEC.
2. Permitir cuentas para resolver (NO CENTRIFUGA!). Aspirar el sobrenadante y lavar las cuentas brevemente en 1 ml de agua tibia EGM-2 medio.

Discusión

Existe un consenso creciente de que en tres dimensiones (3D) en los ensayos de la angiogénesis in vitro ofrecen un modelo que está mucho más cerca el entorno real en vivo que se puede lograr a partir de cultivos en 2D. Es evidente que los sistemas superiores de 3D debe ser reproducible, y ser capaz de imitar a varios de los pasos más importantes de la angiogénesis. Mientras que varios ensayos previa en 3D han sido desarrollados, muchos de estos o bien utilizar difíciles de obtener células microvasculares, o sólo recapitular algunas de las e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perlas Cytodex-3	Reactivo	Amersham	17-0485-01	10 g/frasco. 1.0,5 g de perlas secas se hidratan y hinchan en 50 mL de PBS (pH = 7,4) durante al menos 3 h a temperatura ambiente. Utilice un tubo de 50 mL y colóquelo en el agitador orbital. 2. Deje asentar las perlas (~15 min). Descarte el sobrenadante y lave las perlas durante unos minutos con PBS fresco (50 mL). 3. Descarte el PBS y reemplace con PBS fresco: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 perlas/mL o 50 mL -> 10 mg/mL => 30.000 perlas/mL. 4. Coloque la suspensión de perlas en un frasco de vidrio silanizado (Windshield Wiper o Sigmacote). 5. Esterilice las perlas mediante autoclave durante 15 min a 115°C. 6. Almacénelas a 4°C.
Aprotinina	Reactivo	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/frasco. Reconstituya la aprotinina liofilizada a 4 U/mL en agua desionizada. Filtre estérilmente. Prepare alícuotas de 1 mL cada una. Almacene a -20 °C.
Fibrinógeno Tipo I	Reactivo	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Disuelva el fibrinógeno a 2 mg/mL en DPBS. Tenga en cuenta el porcentaje de proteína coagulable y ajuste en consecuencia. Caliente en un baño de agua a 37 °C para disolver el fibrinógeno. Mezcle invirtiendo el tubo. No vortex. Filtre estérilmente a través de 0,22 µm
Trombina	Reactivo	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1.000 unidades. Reconstituya en agua estéril a 50 U/mL. Prepare alícuotas de 0,5 mL cada una. Almacene a -20 °C.