Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Summary

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles

Protocol

A. cultivo celular y la inducción de proteínas

En esta sección se describen las condiciones de cultivo celular, ciclo celular de sincronización con nocodazole, seguida por la inducción de la expresión de la proteína de un promotor regulable en células de levadura.

1. El tipo salvaje cepa de levadura W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) se transforma con la copia de alta (2μ) plásmido de ADN que contiene nuestro gen de interés (ENTH2) bajo el control de un promotor reprimible metionina (MET25). Metionina 2mM es suficiente para suprimir la actividad del promotor, mientras que los medios de c....

Discussion

Este protocolo describe la manera de supervisar el desarrollo de un fenotipo morfológico (célula de levadura no pueden someterse a la división celular adecuada) a sobreexpresión de la proteína. Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar que la cosecha de células de levadura por granulación a la velocidad de centrifugado se recomienda como una mayor velocidad puede dañar las células y los resultados oscuro. El azul de metileno y el blanco calcofluor debe agregarse a las células vivas justo antes de la i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo de nocodazol		Sigma-Aldrich	M1404
Azul de metileno 1% (p/v)	Reactivo	VWR international	VW6276-0
Reactivo	blanco de calcofluor	Sigma-Aldrich	F3543
Reactivo de gelatina de petróleo		VWR international	VW3339-2