Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Resumen

Tinción inmunohistoquímica suspensión de las células madre pluripotentes (hPSCs) para los marcadores de la superficie celular (SSEA-3/SSEA-4) se logró basada en el uso de un aparato hecho a sí mismo citospina para crear una monocapa de células para la observación y cuantificación.

Resumen

Las células madre pluripotentes (hPSCs) que incluyen células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) son una fuente interesante de células debido a su ilimitada capacidad de auto-renovación y su potencial de diferenciarse en múltiples tipos de células. El estado pluripotente de hPSCs se suele evaluar mediante técnicas como la PCR cuantitativa, inmunocitoquímica, y por otros

Protocolo

Parte 1: La tinción inmunocitoquímica de suspensión

1. Las células se recogen en una suspensión de células individuales.
2. Las células se transfieren a tubos de microcentrífuga de 1,5 2 ml y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos.
3. Se lavan las células mediante la aspiración de sobrenadante, se resuspendieron en 1 ml de PBS - (sin Mg ^{2 +} y Ca ^{2 +)} y luego se centrifuga de nuevo a 200 g durante 4 minutos. Esto debe hacerse dos veces.
4. Después del lavado, las células se fijan por la re-suspensión en paraformaldehído% 1 ml de 4 (PFA) a temperatura ambiente durante 10 minutos.
5. Las células se lavan de nuevo dos veces con 1 ml de PBS -.
6. Después de lavar las células bloque, por volver a suspender en 1 ml de solución de bloque (6% serum/94% PBS -). Incubar estos a temperatura ambiente durante 45 minutos.
7. Después, centrifugar los tubos a 200 g durante 4 minutos y aspirar a la solución de bloque. Vuelva a suspender las células en 1 ml de la solución de anticuerpo primario (hecho con la solución de bloque a la dilución recomendada). Las células pueden ser incubados a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche antes de proceder al siguiente paso.
8. Las células se lavan dos veces con 1 ml de solución de bloque.
9. Después, volver a suspender las células en 1 ml de solución de anticuerpo secundario (hecho con la solución de bloque a la dilución recomendada) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
10. Después de 1 hora, las células se deben lavar de nuevo dos veces con 1 ml de solución de bloque.
11. Después de lavar con solución de bloque, lavar las células de nuevo con 1 ml de PBS -.
12. Después de los lavados diferentes, volver a suspender las células en 1 ml de DAPI tinción nuclear (1:10.000 dilución de DAPI en PBS -) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
13. Después de 5 minutos, centrifugar los tubos a 200 g durante 4 minutos. Aspirar la solución de DAPI nuclear mancha y volver a suspender las células en 1 ml de PBS -.

Parte 2: Incorporación de hPSCs en las diapositivas generadas por el aparato citospina

1. Toboganes de plástico son preparados por lo que la cantidad deseada de agujeros con un taladro. El diámetro debe ser como máximo de 1 mm más grande que el diámetro más ancho de la punta de la micropipeta (s) que se utilizará.
2. Papel de filtro se corta a los parámetros de la corredera de plástico con unas tijeras.
3. Entonces se hacen agujeros en el papel de filtro. El tamaño del agujero (s) debe ser lo suficientemente grande que la punta de la micropipeta (s) queda a su medida a través de él.
4. Después, uno de los toboganes de plástico preparado se coloca en la parte superior y una lámina de vidrio en colocar en la parte inferior del papel de filtro de corte (Figura 1). Las capas están asegurados con cinta adhesiva.
5. Un máximo de 100μL (dependiendo de la densidad deseada monocapa) de la suspensión de células manchadas de la parte 1 se coloca en la parte superior de la punta de la micropipeta (s).
6. Si es necesario, el aparato con una solución de células pueden ser pesados ​​y crearon un contrapeso de un peso similar.
7. El aparato citospina y contrarrestar pueden se colocan en una centrífuga de sobremesa y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos.
8. Después de la centrifugación, el aparato ha sido cuidadosamente citospina desmontado de una manera que doesnt caer las células de la lámina de vidrio.
9. Si es necesario, el exceso de PBS alrededores - en el lado de vidrio en aspirado a cabo.
10. Las células se pueden ver utilizando un microscopio de fluorescencia para comprobar si la monocapa celular deseado ha sido alcanzado.

Parte 3: Montaje de diapositivas

1. Una caída de los medios de montaje deseada se coloca directamente en el centro de cada área que contiene las células.
2. Después, una hoja de cubierta es suave baja en las diapositivas tratando de evitar burbujas de aire si es posible.
3. El exceso de medios de montaje se elimina a partir de diapositivas.
4. Después, los laterales de la cubierta se desliza se sellan con esmalte de uñas.
5. Las diapositivas se pueden mantener en un área de almacenamiento en la oscuridad hasta que los resultados son observados y documentados.

Discusión

A los efectos de nuestro laboratorio, un plato de 35 mm de cultivos de células madre cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEFs) es asignado para el procedimiento de tinción inmunohistoquímica para su uso con el aparato cytospin. Las células se recogen por medio de pases enzimática, eliminar la mayor cantidad de la capa de MEF como sea posible, en una suspensión de una sola célula. Si más eficaz de aislamiento de células madre de la capa de MEF se desea, las colonias pueden ser recogidos manualmente después s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lab Tek Permanox Portaobjetos de cámara	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material para portaobjetos de plástico reutilizados
Portaobjetos de microscopio Superfrost/Plus Prelimpiados	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μ L Puntas de filtro USA Scientific	, Inc.	1121-3810
Cubierta de cristal para microscopio	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Medio
de montaje DPBS	GIBCO, de Life Technologies	14190
Suero de cabra normal	Invitrogen	10000C
Anticuerpo monoclonal anti-SSEA-4 para ratones	EMD Millipore	MAB4304	Anticuerpo primario para la tinción de SSEA-4
Anticuerpo monoclonal anti-SSEA-3	ratas EMD Millipore	MAB4303	Anticuerpo primario para la tinción de SSEA-3
Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-ratón	Invitrogen	A11029	Anticuerpo secundario para la tinción de SSEA-4
Alexa Fluor 488 Tagged anti-rata de cabra	Invitrogen	A11006	Anticuerpo secundario para la tinción de SSEA-3
DAPI, diclorhidrato	Calbiochem	268298