Crónico Salmonella Modelo de ratón infectado

Resumen

Establecer un modelo de crónica bacteriana ratones infectados con el persistente Salmonella Typhimurium colonización en el intestino durante 27 semanas.

Resumen

El modelo de ratón infectado de bacterias es un sistema poderoso modelo para el estudio de áreas tales como infección, inflamación, la inmunología, la transducción de señales y tumorigénesis. Muchos investigadores han tomado ventaja de la colitis inducida por

Protocolo

Este protocolo incluye tres partes: la detección de un cultivo bacteriano, una sonda de ratón, y Salmonella.

1. Salmonella condiciones de crecimiento.

1. Prepare la Salmonella caldo Luria-Bertani (LB) placa, se incuba a 37 ° C durante la noche.
2. Elige un clon de la placa de LB y puesto en LB 7 ml en un tubo de 12 ml y agitar a 37 º C durante 5 horas.
3. Inocular 50 ml de LB con 0,05 ml de un cultivo en fase estacionaria y se incuba a 37 ° C sin agitación durante aproximadamente 18 horas.
4. Giro cultivo bacteriano durante la noche a temperatura ambiente con 6000 rpm durante 10 minutos, suspender las bacterias en HBSS con relación 100:3 (LB: HBSS). Por ejemplo:
   Cada cultura LB 50 ml se suspenderá en 1,5 ml HBSS.
5. Para la alimentación forzada de animales, diluir aún más el cultivo bacteriano en una proporción de 1:10. Por ejemplo:
   Todas las culturas de 1,5 ml LB será suspendido en 15 ml HBSS.

2. Salmonella infección modelo *.

1. Prepare la solución de estreptomicina. Cada ratón se le dará 7,5 mg de estreptomicina en 100 l HBSS. Por ejemplo, prepare un total de 90 mg de estreptomicina en 1,2 ml de HBSS 10 ratones. Siempre tienen algo de volumen extra en la preparación de la solución de estreptomicina.
2. Retirar el agua y la comida 4 horas antes del tratamiento de una sonda nasogástrica.
3. Ratones sonda con estreptomicina con 7,5 mg de estreptomicina (100 l de HBSS para los ratones de control). Coge la piel sobre el hombro del ratón firmemente con el pulgar y el dedo medio, estirar la cabeza y el cuello con el dedo índice para hacer que el esófago directamente. Dirigir el balón de punta de la aguja de alimentación a lo largo del techo de la boca y hacia el lado derecho de la parte posterior de la faringe, y luego suavemente pase hacia el esófago y se inyecta la solución de 100 l. No hay resistencia se debe sentir.
4. A las 20 horas después del tratamiento con estreptomicina, el agua extraída y la comida de nuevo antes de los ratones infectados con la bacteria.
5. Sonda cada ratón con 100 l de suspensión en HBSS o tratados con HBSS estéril (control) mediante una sonda nasogástrica. El procedimiento de alimentación forzada es lo mismo que 2.3) ratones sonda con estreptomicina.

* Experimentos con animales se realizaron mediante el uso de patógenos específicos libre C57BL mujeres / 6 ratones (Taconic, Hudson, Nueva York), que fueron 6-7 semanas de edad, como se describió anteriormente ^1. El protocolo fue aprobado por la Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animales (UCAR).

3. La detección de Salmonella en el intestino.

1. Recoger las heces de ratón (100 mg).
2. Transferencia de la muestra fecal en un tubo de centrífuga de 1,5 micro con 1 ml de PBS y agitar vigorosamente.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 800 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
4. Centrifugación a 6000 rpm durante 5 minutos. Sobrenadante se descarta y 200 l de PBS se añade a los gránulos y vortex.
5. La racha de 200 l de PBS con un esparcidor celular desechable en una placa BBL CHROMagar para detectar Salmonella. Especies de Salmonella aparecen de color malva (rosa a púrpura, ver figura 1). Si los rendimientos de 200 l colonias demasiados en la placa, utilice 100 l ó 50 l durante la racha.

4. Los resultados representativos.

Cuando el protocolo se hace correctamente, Salmonella typhimurium colonización se puede detectar en el intestino del ratón más de 6 meses. Salmonella pueden ser detectados por cultivo fecal más de 6 meses (Fig. 1). Como fuera típica vienen de este modelo, el cuerpo de pérdida de peso y la muerte ocurren dentro de las 4 semanas después de la infección. Depende de las cepas de Salmonella utilizados para la infección, algunos ratones no pueden sobrevivir más de 6 meses.

Figura 1. Salmonella Intestinal en la especie Salmonella aparecen de color malva (rosa a púrpura) en color, debido a las diferencias metabólicas en presencia de cromógenos seleccionado. Otras bacterias son inhibidas o producen colonias de color azul-verdoso o incoloro.

Figura 2. Proporciones de supervivencia de ratones infectados con Salmonella cepa mutante ^c PhoP, PhoP ^c Avra, y PhoP ^c AvrA-/AvrA +, ^c PhoP Avra durante 4 semanas (28 días).

Tabla 1. Peso corporal de los ratones infectados con Salmonella durante 4 semanas.

	0	1 semana	2 semanas	3 semanas	4 semanas
control	16,78 ± 1,05	16,91 ± 1,28	18,26 ± 1,23	19,31 ± 1,26	20,26 ± 1,15
PhoP c	16,89 ± 1,03	17,14 ± 1,19	17,43 ± 1,63 *	18,68 ± 1,78	20,05 ± 1,11
PhoP c Avra-	16,91 ± 1,12	16,96 ± 1,39	17,06 ± 2,14 **	18,71 ± 2,18	20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA +	16,94 ± 0,96	17,17 ± 1,02	17,63 ± 1,42 *	18,44 ± 2,03	20,09 ± 1,17

* En comparación con el grupo control p <0,05
** En comparación con el grupo control p <0,01

Tabla 2. Cepas de Salmonella utilizada en este estudio.

Nombre	Descripción	Referencia o fuente
Salmonella 14028s	De tipo salvaje S. typhimurium	ATCC
PhoP c	No patógenos mutantes regulador complejo	Miller et al., 1990
PhoP c Avra-	Avra-mutación	Collier-Hyams et al., 2002
PhoP c AvrA-/AvrA +	PhoP c Avra Avra complementa con plásmido que codifica	Collier-Hyams et al., 2002

Discusión

Para utilizar este sistema, es necesario que el investigador que aprender a alimentación forzada de los animales. Se detalla una metodología para preparar un cultivo bacteriano y alimentación forzada de los ratones. También muestra cómo controlar la persistencia de Salmonella en el tracto gastrointestinal (GI). Los pasos críticos de este protocolo, incluyendo:

1. Estreptomicina pretratamiento: estreptomicina pretratamiento podría deshacerse de algunos flora intestinal comensal y que los ratones suscep...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Caldo Luria-Bertani	BD Biosciences	244610
Aguja de alimentación	Popper & Sons, Inc.	7920
Estreptomicina	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Esparcidores celulares desechables	Biologix Research Company	65-1010