Este video muestra la técnica para extraer el ADN de las especies de microbios residentes en el intestino de termitas. La preparación de una diapositiva en fresco, que es útil para la visualización de la comunidad microbiana intestinal también se ilustra, y un recorrido por la riqueza de especies entorno intestinal es dado.
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Artículo de método
Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales
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Resumen
Resumen
Las termitas se encuentran entre los pocos animales que sabe que tiene la capacidad de subsistir únicamente por el consumo de madera. El tracto intestinal termita contiene una población microbiana densa y rica en especies que contribuye a la degradación de la lignocelulosa predominantemente en acetato, el metabolismo de los nutrientes clave alimentando termitas (Odelson y Breznak, 1983). Dentro de estas poblaciones microbianas son bacterias, arqueas metanogénicas y, en algunos termitas ("menor"), eucariotas protozoos. Por lo tanto, las termitas son sujetos de investigación de excelencia para el estudio de las interacciones entre especies microbianas y las numerosas funciones bioquímicas que llevan a cabo en beneficio de su anfitrión. La composición de las especies de las poblaciones microbianas en el intestino de las termitas, así como los principales genes involucrados en diversos procesos bioquímicos se ha estudiado mediante técnicas moleculares (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi y Leadbetter, 2003). Estas técnicas dependen de la extracción y purificación de alta calidad, ácidos nucleicos del ambiente intestinal de termitas. La técnica de extracción se describe en este video es una compilación de modificación de los protocolos desarrollados para la extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras ambientales (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi y Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) y que produce material de ADN de las termitas del intestino grueso adecuado para su uso como plantilla para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
Protocolo
Resumen del procedimiento para la extracción de ADN de las termitas de todo el intestino:
- Las termitas se enfría en hielo, retire del intestino utilizando pinzas estériles y estabilizar muestras de intestino en el buffer.
- Homogeneizar las muestras de PVPP / SDS / buffer de fenol.
- Extraer y purificar el ADN de lisado crudo utilizando columnas Qiagen DNeasy.
Protocolo:
- En el hielo, remover las entrañas de las termitas casta de obreras con una pinza estéril.
- Inmediatamente la transferencia de las agallas y el contenido de una solución estéril, libre de nucleasa tubo que contiene 50 L helada 1x biología molecular grado buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelar las muestras a -20 ° C, o proceder directamente a una homogeneización.
- Transferencia de las muestras de intestino y de amortiguación de una solución estéril, libre de nucleasa 2 ml tubo de tornillo tope pre-cargado con 500 mg de estériles de zirconia / sílica perlas (0,1 mm) y 700 l de 1x tampón TE que contenía 1% w / v polivinilpolipirrolidona (PVPP ).
- Añadir 50 l de sulfato de sodio al 20% dodecilsulfato (SDS) y 500 l de fenol para las muestras.
- Homogeneizar (golpe del talón) sobre el valor más alto con tres ciclos de 30 segundos homogeneización y 30 segundos de enfriamiento en hielo.
- Sedimentos material insoluble durante 1 minuto a 8000 x g.
- Purificar 300 l alícuotas de la fase acuosa (superior) de la capa de columnas Qiagen DNeasy utilizando el método descrito para la purificación del lisado crudo.
- Cuantificar el contenido de ácido nucleico y las muestras se congelan a -20 ° C para su uso posterior.
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Discusión
En nuestra experiencia, el ADN extraído de las comunidades microbianas de la alimentación de especies de termitas de madera como nevadensis Zootermopis es lo suficientemente puro para la plantilla de PCR después de una ronda de extracción y purificación. Sin embargo, algunas termitas tales como basura de alimentación y especies que se alimentan del suelo pueden tener una mayor concentración de ácidos húmicos en el contenido intestinal y puede requerir una purificación adicional de ADN microbiano intestinal. El rendimiento total de ADN de la...
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/fenol | Tampón | tampón de homogeneización | ||
| Kit DNeasy Tissue | Kit | Qiagen | 77607 | Utilizado según el protocolo para el aislamiento de ADN genómico a partir de lisados crudos (Apéndice H, versión del manual del producto: julio de 2003) |
| TE | Tampón | Sigma-Aldrich | T9285 | tampón 1x (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) a partir de concentrado 100x |
| esferas de circonia/sílice | Suministros | Biospec Products | 11079101z | 0,1 mm |
| PVPP | Reactivo | Sigma-Aldrich | P6755 | polivinilpolipirrolidona al 1 % p/v preparada a partir del reactivo seco como suspensión 1x en tampón TE |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termitas | ||
| SDS | Reactivo | Sigma-Aldrich | L4390 | solución al 20 % de dodecilsulfato sódico en agua, a partir del reactivo seco |
| Fenol | Reactivo | Sigma-Aldrich | 77607 | saturado con TE, ~73 % |
| MiniBeadbeater-8 | Herramienta | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Solución salina tamponada, pH 7,2 | Fórmula por litro: 2,5 g K2HPO4, 1,0 g KH2PO4, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl y 10 mL de una solución 1 M de NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscopio | Carl Zeiss, Inc. | Equipado con objetivo 40x, optivar 1,6x y lentes oculares 10x. Las muestras se observaron utilizando iluminación de contraste de fases |
Referencias
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
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Reimpresiones y permisos
