Los aptámeros son ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corto seleccionado por In-vitro Métodos de la evolución basada en la afinidad de un objetivo específico. Los aptámeros son herramientas de reconocimiento molecular con la versatilidad de las aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Demostramos métodos para la selección de aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causal de la enfermedad de Alzheimer.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva, dependiente de la edad, enfermedades neurodegenerativas con un curso insidioso que hace que su diagnóstico presintomático difícil 1. Diagnóstico del TDA definitiva se logra sólo postmortem, estableciendo así el diagnóstico presintomático, precoz de la EA es crucial para desarrollar y administrar tratamientos eficaces 2,3.
Β-amiloide, proteína (Aß) es fundamental para la patogénesis de la EA. Asambleas soluble, Aß oligoméricas se cree que afecta a la neurotoxicidad de la disfunción sináptica y la pérdida de neuronas en el año 4,5. Diversas formas de Aß soluble asambleas se han descrito, sin embargo, sus interrelaciones y la importancia de la etiología y la patogénesis de AD son complejos y no se entiende bien 6. Herramientas específicas para el reconocimiento molecular pueden desentrañar las relaciones entre los conjuntos de Aß y facilitar la detección y caracterización de estos conjuntos de principios en el curso de la enfermedad antes de aparecer los síntomas. Reconocimiento molecular comúnmente se basa en anticuerpos. Sin embargo, una clase alternativa de herramientas de reconocimiento molecular, aptámeros, ofrece importantes ventajas con respecto a los anticuerpos 7,8. Los aptámeros son oligonucleótidos generados por in-vitro de selección: la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX es un proceso iterativo que, al igual que la evolución darwiniana, permite la selección, amplificación, el enriquecimiento y la perpetuación de una propiedad, por ejemplo, ávida, específica, de unión al ligando (aptámeros) o la actividad catalítica (ribozimas y ADNzimas).
Pesar de la aparición de aptámeros como herramientas de la biotecnología moderna y la medicina 11, han sido poco utilizados en el campo de amiloide. Pocos o ARN aptámeros ssDNA han sido seleccionados contra las distintas formas de proteínas priónicas (PrP) 12-16. Un aptámero ARN generados contra PrP bovina recombinante ha demostrado que reconocer bovina PrP-β de 17 años, soluble, oligómero, β-hoja-rica variante de conformación de larga duración PrP que forma fibrillas de amiloide 18. Aptámeros generado con las formas monoméricas y varios de β fibrilar se encontraron 2-microglobulina (β 2 m) para enlazar las fibrillas de ciertas proteínas amiloidogénica otros, además de las fibrillas de β 2 m 19. Ylera et al. describe aptámeros de ARN seleccionados en contra inmovilizado monoméricas Aβ40 20. Inesperadamente, estos aptámeros obligado fibrilar Aβ40. En conjunto, estos datos plantean varias cuestiones importantes. ¿Por qué aptámeros seleccionado frente a las proteínas monoméricas reconocer sus formas poliméricas? Podría aptámeros contra las formas monoméricas y / o de las proteínas oligoméricas amiloidogénica se obtiene? Para abordar estas cuestiones, hemos intentado seleccionar aptámeros para covalentemente estabilizado oligoméricas Aβ40 21 generados usando foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) 22,23. Similar a los hallazgos previos 17,19,20, estos aptámeros reaccionaron con fibrillas de Aß y otras proteínas amiloidogénica probable que el reconocimiento de un amiloide potencialmente estructural común aptatope 21. A continuación, presentamos la metodología SELEX utilizados en la producción de estos aptámeros 21.
Protocolo
Parte 1: preparación de la proteína y el cross-linking
Inicialmente, la proteína utilizada para SELEX se trata previamente con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener homogénea, global sin preparación, como se describió previamente 23. Este paso es necesario porque preformados agregados inducir la agregación de las proteínas de rápida amiloidogénica, resultando en una mala reproducibilidad experimental 24, y no son deseables para la selección de aptámeros de forma desagregada, no fibrilar formas de la proteína.
- Pesar 800 mg ~ (~ 180 nmol) puro Aβ40 usando una microbalanza. Transferir el pépti....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El punto de partida del proceso SELEX es la síntesis de oligonucleótidos de una biblioteca al azar por lo general con 10 12 -10 15 secuencias. En el ADN SELEX, esta biblioteca se utiliza inmediatamente después de una piscina ssDNA se genera, mientras que en el ARN SELEX, ha demostrado aquí, la biblioteca de ADN de cadena simple se convierte primero en un grupo de ARN enzimáticamente por la transcripción in vitro. Entonces, SELEX se realiza iterativamente mediante el cual cada ciclo compren.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas AG030709 de NIH / NIA y 07-65798 del Departamento de Salud de California. Reconocemos Margaret M. Condron para la síntesis de péptidos y análisis de aminoácidos, la Dra. Elizabeth F. Neufeld para ayudar y apoyar a los pasos iniciales del proyecto, el Dr. Chi-Hong Chen B. de proporcionar apoyo y reactivos, y el Dr. Andrew D. . Ellington útil para los debates.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aβ40 | Laboratorio de Biopolímeros de la UCLA | Polvo liofilizado | |
| MX5 Automatizada-S Microbalanza | Mettler Toledo | ||
| Tubos de 1,6 ml recubiertos con silicona | Denville Scientific | C19033 o C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Utilice en una campana extractora. |
| Peroxidisulfato de amonio | Sigma-Aldrich | A-7460 | Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. El APS se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h. |
| Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) hexahidrato | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. Cubra el tubo de RuBpy con papel de aluminio para proteger el reactivo de la luz ambiental. El RuBpy se prepara fresco cada vez y debe utilizarse dentro de las 48 h. |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-Salt™ Excellulosa™ columnas de desalado | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| acetato de amonio | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Tubos recubiertos de silicona, de 0,6 ml | Denville Scientific | C19063 | |
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10 pocillos; tamaño mini (8 cm X 8 cm); 25 μl volumen de carga por pocillo; rango de separación de 5 kDa a 40 kDa |
| Cubeta de cuarzo | Hellma | 105.250-QS | |
| Beckman DU 640 espectrofotómetro | Beckman Coulter Inc. | ||
| biblioteca de ADN de cadena sencilla | Integrated DNA Technologies | Pedido personalizado | La biblioteca fue diseñada para contener 49 nucleótidos aleatorios flanqueados por dos regiones constantes que poseen sitios de unión para cebadores y de clonación: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| Taq DNA polimerasa | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Recombinante Thermus aquaticus ADN polimerasa suministrada con 10× Tampón de PCR y un tubo separado de MgCl₂ 25 mM2 para PCR de rutina. |
| Mezcla de nucleótidos para PCR, solución 10 mM | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (10 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Cebador directo | Integrated DNA Technologies | Pedido personalizado | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Primer inverso | Integrated DNA Technologies | Pedido personalizado | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Ciclador térmico | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| Kit de Purificación QIAquick PCR (50) | Qiagen | 28104 | |
| Agarosa | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Tubos cónicos estériles de 1,6 ml con tapas sujetas con anillos tóricos | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Sistema de producción de ARN a gran escala–T7 | Promega Corp. | P1300 | El kit contiene: 120 μl Mezcla de enzimas (ARN polimerasa, RNasin recombinante)® inhibidor de ribonucleasa e inorganic pirofosfatas recombinante); 240 μl tampón de transcripción 5; 100 μl cada uno de 4 rNTPs, 100 mM; 110 U de DNasa RQ1 libre de RNasa, 1 U/μl; 10 μADN de control lineal, 1 mg/ml; 1 ml de acetato de sodio 3 M (pH 5,2); 1,25 ml de agua libre de nucleasas |
| α-32P-citidina 5’-trifosfato, 250 μCi (9,25 MBq), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Actividad específica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, Tricina 50 mM (pH 7,6) |
| Fenol saturado con citrato:cloroformo:alcohol isoamílico (125:24:1, pH 4,7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Etanol absoluto para biología molecular | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Microcentrífuga refrigerada Z216-MK | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ Columnas Micro G-50 | GE Healthcare | Obtenido de Fisher Scientific (45-001-487) | Precargado con Sephadex™ G-50 grado ADN y pre-equilibrado en tampón STE que contiene 0,15 % de Kathon como biocida |
| Contador de centelleo Triathler de sobremesa | Hidex Oy, Turku, Finlandia | Modelo LSC Triathler: 425-034 | |
| Novex® Tampón de muestra TBE-Urea (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| Geles de TBE-Urea al 6%, 1,0 mm, 10 pozos | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® Tampón de electroforesis para TBE (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Descontaminante de radioactividad | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Puntas para carga de geles | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell SureLock Mini-célula | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-célula |
| Película de auto radiografía | Denville Scientific | E3018 | Utilice en completa oscuridad |
| Película de auto-radiografía, Hyperfilm™ ECL | Amersham | RPN3114K | Puede utilizarse bajo luz segura roja. |
| Discos de membrana | EMD Millipore | GSWP02500 | Ester de celulosa mixto, hidrófilo, 0.22-μmembranas de disco m |
| Base de soporte de vidrio fritado para matraz de 125 ml | VWR international | 26316-696 | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Glucógeno | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-Propanol para biología molecular | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Inhibidor recombinante de RNasa | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Sistema de transcripción inversa | Promega Corp. | A3802 | |
| Inhibidor recombinante de RNasa | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Colorante de carga | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
Referencias
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's d....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
