Flash de congelación y muestras criostáticas E12.5 cerebro de ratón

Resumen

Se demuestra en este vídeo son las técnicas de congelación para el flash y el corte del tejido cerebral de embriones de ratón. Consejos útiles para el uso del criostato se les da, incluyendo los métodos de solución de problemas que se pueden utilizar durante el corte para asegurar que las secciones de tejidos resultantes están libres de grietas y otras distorsiones.

Protocolo

1. Fijar el tejido en el 4% paraformaldehido en PBS durante el tiempo deseado.
2. Sacarosa infundir tejido (crioprotector)
   1. Hacer 30% de solución de sacarosa en PBS w / v en 2059 tubo.
   2. Enjuague el tejido 3 veces en PBS (~ 5 min con la oscilación).
   3. Coloque el tejido en una solución de sacarosa al 30%. Tejido no se hunda.
   4. Coloque el tejido en 4 ° C durante la noche, o hasta que se ha hundido.
3. Tamaño de la etiqueta apropiada cryomold con información y orientación.
4. Rellene con cryomold octubre (evitar las burbujas).
5. La transferencia de tejido para baño octubre y cubrir con octubre
6. La transferencia de tejido para octubre en cryomold.
7. Orientar el tejido al microscopio.
8. Vierta el nitrógeno líquido en placa Petri de plástico.
9. De forma rápida y cuidadosamente baje el tejido en cryomold en el nitrógeno. (No sumergir la parte superior de la cryomold.)
10. Cuando el OCT es un sólido blanco, coloque el tejido congelado en -80 ° C congelador para el almacenamiento.
11. Equilibrar los tejidos a ~ 20 ° C durante al menos 30 min. antes de cortar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Molde criogénico Tissue-Tek	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Solución de sacarosa			solución de sacarosa al 30% en PBS p/v
paraformaldehído			paraformaldehído al 4% en PBS