En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la fluorescencia In vivo Pruebas que cuantificar por separado la recombinación homóloga y no homóloga fin de unirse en células de mamíferos.
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Artículo de método
El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero
En este artículo
Resumen
Resumen
ADN de doble filamento se rompe son las lesiones del ADN más peligrosa que puede conducir a la pérdida masiva de información genética y la muerte celular. Las células de reparación de DSBs con dos vías principales: no homólogos fin de unirse (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Las perturbaciones de NHEJ y de recursos humanos a menudo se asocian con el envejecimiento prematuro y la tumorogénesis, por lo tanto es importante tener una forma cuantitativa de medición de cada vía de reparación del OSD. Nuestro laboratorio ha desarrollado estructuras fluorescentes reportero que permiten la medición sensible y cuantitativo de NHEJ y de recursos humanos. Las construcciones se basan en un gen GFP diseñado que contiene sitios de reconocimiento para un poco de corte I-II CPE endonucleasa para la inducción de DSBs. Las construcciones de partida son las buenas prácticas agrarias negativas como el gen de la GFP se inactiva por un exón adicional, o por mutaciones. Éxito de la reparación de la I-SCE-inducida por NHEJ rompe o HR restaura el gen GFP funcional. El número de células GFP positivos contados por citometría de flujo proporciona una medida cuantitativa de NHEJ o la eficiencia de recursos humanos.
Protocolo
En este protocolo se describe el método para el análisis de la reparación del ADN con el reportero del OSD integrado cromosómicamente construcciones de 1,2 en DSBs son inducidos en vivo por la expresión transitoria una endonucleasa de corte rara I-SCE 3. El ensayo integrado proporciona la ventaja de analizar la reparación del OSD en el contexto de los cromosomas. Sin embargo, este protocolo requiere células prolongada pases, lo que puede ser problemático cuando se trabaja con células primarias.
Un enfoque alternativo es un ensayo extracromosómico en reportero construcciones se digieren in vitro con ....
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Discusión
Los fluorescentes NHEJ y ensayos HR reportero proporcionan una forma cuantitativa para medir por separado cada vía de reparación del OSD en vivo. Los ensayos son muy sensibles, como FACS puede detectar con fiabilidad 10 células GFP + de 20.000 células. Los ensayos pueden ser adaptados para medir los eventos de reparación en "tiempo real" mediante la detección de la aparición de células GFP + en minutos u horas después de la inducción de DSBs 2. Además, el análisis de las células GFP + no se.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El original GFP-Pem1 fue un regalo del doctor Li Lei. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH y la Ellison Medical Foundation de VG y AS
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit EndoFree Plasmid Maxi | Qiagen | 12362 | |
| Kit de extracción de gel Qiaex II | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticina (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Tubos redondos de fondo redondo | BD Biosciences | 352058 | Tubos FACS |
Referencias
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V.
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