Montaje de cerebros adultos de Drosophila: un método para preparar portaobjetos para la obtención de imágenes confocales

Este protocolo es un extracto de Kelly et al., Disección y tinción inmunofluorescente de neuronas fotorreceptoras y cuerpo de hongo en cerebros adultos de Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaje de cerebros adultos de D. melanogaster en portaobjetos de microscopio e imágenes

1. Construye un tobogán de "puente". Coloque dos cubreobjetos "base" a una distancia aproximada de 1 cm en un portaobjetos cargado positivamente. Asegúrese de que el lado cargado positivamente de la guía esté hacia arriba. Adherir los cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas como se muestra en Figura 1A. Por lo general, es útil sellar los tres bordes exteriores de cada deslizamiento de la cubierta de la base con esmalte de uñas para garantizar que los medios de montaje no se absorban debajo de estos deslizamientos de la cubierta de la base. Deje que el esmalte de uñas se seque completamente (10 a 15 minutos) antes de continuar.
2. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio estereoscópico y pipetee la solución de medios de montaje que contiene los cerebros disecados en el espacio entre los dos cubreobjetos. Para proporcionar más contraste, es útil maniobrar las luces de cuello de cisne para que queden paralelas a la mesa de trabajo.
3. Retire el soporte de montaje adicional del portaobjetos con una pipeta, teniendo cuidado de no pipetear los cerebros del portaobjetos.
4. Absorba los medios de montaje adicionales. Esto permitirá que los cerebros se posicionen con mayor precisión durante el siguiente paso.
5. Usando un par de pinzas y el microscopio estereoscópico, coloque los cerebros en el portaobjetos en un patrón de cuadrícula con los lóbulos de las antenas hacia arriba.
6. Coloque un cubreobjetos (el "puente") sobre el cerebro (Figura 1A). Use esmalte de uñas para sellar los lados del deslizamiento de la cubierta del puente donde entran en contacto con los deslizamientos de la cubierta de la "base".
7. Con una pipeta p200, llene lentamente la cavidad central debajo del puente con medios de montaje nuevos (Figura 1B). Coloque una gota a la vez en el borde abierto del cubreobjetos central y permita que el medio de montaje se absorba debajo del cubreobjetos del puente central. Continúe hasta que toda la cavidad esté llena con medios de montaje, luego selle la parte superior e inferior con esmalte de uñas transparente.
8. Una vez que el esmalte de uñas esté seco, tome una imagen de las diapositivas inmediatamente o guárdelas en una caja hermética resistente a la luz a -20 ° C.
9. En el plazo de una semana, se obtienen imágenes del cerebro utilizando un microscopio confocal de barrido láser con láseres de excitación y cubos de filtro adecuados para los anticuerpos secundarios fluorescentes elegidos. Las imágenes de pila Z de las neuronas del cuerpo de los hongos generalmente se obtienen usando objetivos de 20X o 40X. Las imágenes de las neuronas fotorreceptoras de la retina pueden requerir un mayor aumento.

Figura 1: Montaje de cerebros en preparación para la obtención de imágenes de inmunofluorescencia. (A) Los cerebros están montados en portaobjetos SuperFrost Plus con una cubierta de puente para evitar el aplanamiento de los cerebros. Dos cubreobjetos "base" se adhieren a un portaobjetos Superfrost Plus cargado positivamente con esmalte de uñas transparente y luego se colocan cerebros diseccionados en el portaobjetos entre ellos. Se coloca un cubreobjetos transparentes de "puente" sobre los cerebros y se adhiere a los cubreobjetos de la base. (B) Una vez que el esmalte de uñas se ha secado, Vectashield se pipetea lentamente debajo del puente para preservar la fluorescencia del anticuerpo secundario. A continuación, se utiliza un esmalte de uñas transparente para sellar la parte superior e inferior del cubreobjetos del "puente". Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.