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Este protocolo es un extracto de Zhang et al, El intestino de C. elegans como modelo para la morfogénesis del lumen intercelular y la biogénesis de la membrana polarizada in vivo a nivel de una sola célula: etiquetado por tinción de anticuerpos, análisis e imágenes de pérdida de función de ARNi, J. Vis. Exp. (2017).
Tinción de anticuerpos en el intestino de C. elegans
- fijación
- Tome un portaobjetos de vidrio limpio y use poli-L-lisina para generar una película delgada para que los gusanos se peguen. Coloque 30 μL 0,1-0,2% de poli-L-lisina en el portaobjetos y coloque un segundo portaobjetos en la gota de poli-L-lisina para hacer un "sándwich". A continuación, frote los portaobjetos suavemente unas cuantas veces para mojar todas las superficies de ambos y déjelos secar al aire durante 30 min. Etiquete el lado esmerilado de las diapositivas con lápiz.
NOTA: Las alícuotas de poli-L-lisina al 0,2% de 200 μL se hicieron disolviendo el polvo en dH2O; esto se puede almacenar a -20 °C. Utilice poli-L-lisina de alto peso molecular para mejorar la adherencia de los gusanos. La concentración de poli-L-lisina también es crítica. Concentraciones demasiado bajas no permitirán que los gusanos se peguen, pero concentraciones demasiado altas pueden generar una señal de fondo de fluorescencia. Una película demasiado gruesa puede aflojarse en su totalidad.
- Coloque firmemente un bloque metálico plano en el fondo de un recipiente (por ejemplo, un recipiente de poliestireno) lleno de nitrógeno líquido.
NOTA: En su lugar, se puede usar hielo seco, pero el nitrógeno líquido mantiene un bloque de metal más estable en el fondo del recipiente y se enfría bien.
- Recoja gusanos lavándolos de sus placas con M9 o elija gusanos de diferentes etapas (ya sea huevos, gusanos de etapa larvaria L1, L2, L3 o L4) en cada portaobjetos. Por lo general, elija ~ 100 larvas y embriones o ~ 20 adultos para cada portaobjetos. Coloque 10 μL de lombrices lavadas en el centro del portaobjetos o recoja huevos/lombrices en 10 μL M9 o 10 μL 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato).
- Utilice una pipeta para esparcir un gran número de lombrices y evitar que se aglomeren.
Nota: Las poblaciones mixtas de gusanos lavados, debido al hacinamiento y al diferente grosor de las etapas, no se adhieren bien y se congelan de manera menos efectiva (ver más abajo), por lo tanto, la selección de gusanos específicos de la etapa (o poblaciones sincronizadas) da resultados superiores. Las larvas se adhieren mejor que los adultos y se pueden colocar más animales por portaobjetos.
- Antes de recoger gusanos en portaobjetos, transfiéralos a una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sin bacterias OP50. El exceso de bacterias adheridas a los gusanos también puede interferir con la adherencia. Tenga cuidado de que los gusanos no se sequen.
- Coloque (deje caer) suavemente un cubreobjetos de 22 mm × 22 mm transversalmente encima de los gusanos recolectados, de modo que sus bordes cuelguen al menos de un lado del portaobjetos. Presione hacia abajo suave pero firmemente con uno o dos dedos en el cubreobjetos. Evite el cizallamiento que dañe la integridad del tejido.
- Transfiera inmediata y suavemente el portaobjetos al bloque de metal en nitrógeno líquido y déjelo reposar durante unos 5 minutos para que se congele. A continuación, "sacuda" el cubreobjetos de un solo movimiento utilizando el borde que sobresale.
NOTA: Este paso debe realizarse con decisión y mientras se congela el portaobjetos para lograr el "agrietamiento" de la cutícula. Precaución: Siga las pautas de EPP (Equipo de Protección Personal) cuando trabaje con nitrógeno líquido.
- Sumerja los portaobjetos congelados en un frasco Coplin de vidrio lleno de metanol durante 5 minutos a -20 °C. Luego transfiera a un frasco de vidrio Coplin lleno de acetona durante otros 5 minutos a -20 ° C.
NOTA: El metanol y la acetona deben almacenarse a -20 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso. Después de la fijación, los portaobjetos se pueden almacenar a -20 °C.
ATENCIÓN: el metanol y la acetona son tóxicos.
- Retire los portaobjetos del frasco y déjelos secar al aire a temperatura ambiente (RT) antes de usarlos.