Este protocolo es un extracto de Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Preparación de portaobjetos para la adquisición de imágenes
- Prepare caldo de agarosa al 3-4% p/v en una botella apta para microondas (3-4 g en 100 ml de agua ultrapura).
NOTA: El agar se puede utilizar en lugar de la agarosa en la misma concentración.
- Derrita la agarosa con cuidado en un horno de microondas, teniendo cuidado de no hervir demasiado, hasta que toda la agarosa se disuelva (solución clara). Mantenga la solución a 70 °C para evitar la solidificación.
NOTA: El caldo de agarosa se puede utilizar varias veces. Vuelva a calentar antes de usar si la agarosa se ha solidificado.
- Con una pipeta Pasteur, coloque una gota de agarosa derretida en un portaobjetos de microscopio.
NOTA: Evite tener burbujas de aire en la gota de agar, ya que alteran la integridad de la almohadilla.
- Presione inmediatamente la gota de agarosa con otro portaobjetos del microscopio, aplanando suavemente la agarosa en una almohadilla entre los dos portaobjetos.
NOTA: Las burbujas sobrantes deben eliminarse en esta etapa. De lo contrario, se deben hacer nuevos toboganes, ya que los animales pueden quedarse atrapados fácilmente en las burbujas. Evite el desbordamiento de agar hacia un lado al presionar la corredera.
- Deja secar la agarosa durante 1 min.
- Separe con cuidado los dos portaobjetos para evitar daños a la agarosa, dejando la almohadilla solidificada en uno de los portaobjetos.
NOTA: Los portaobjetos con almohadillas de agarosa siempre deben prepararse frescos justo antes del experimento, ya que pueden secarse. Asegúrate de que la almohadilla de agarosa tenga un grosor constante. No debe haber burbujas de aire ni grietas en la almohadilla, ya que esto puede interferir con la imagen.
- Agregue una pequeña gota (5-10 μL) de clorhidrato de tetramisol al 0,05% (anestésico) en el centro de la almohadilla de agarosa.
- Con un pico esterilizado por calor, transfiera rápidamente entre 10 y 15 animales de la placa de culata a la gota de anestésico antes de que la solución se seque. Evite transferir demasiadas bacterias OP50, ya que esto hace que la solución se vuelva turbia, lo que puede interferir con la obtención >NOTA: Si la solución anestésica se seca durante la recolección, simplemente pipetee una segunda gota de clorhidrato de tetramisol al 0,05% sobre los animales. Los animales tienden a acostarse sobre su lado lateral en la solución anestésica.
- Aplique un cubreobjetos colocándolo justo encima de la almohadilla de agarosa y dejándolo caer suavemente. Esto evitará la formación de burbujas. No aplique presión sobre el cubreobjetos, ya que esto puede aplastar a los animales.
- Etiqueta los portaobjetos con el nombre de la cepa.