El método de la ureasa de preparación de muestras para análisis GC / MS de metabolitos intermedios es presentado por su inventor. El método permite un paso de seguimiento de cribado neonatal de errores congénitos por espectrometría de masas en tándem de los hidratos de carbono cuantificar, orgánicos y aminoácidos a todos en un solo proceso.
Artículo de método
De un solo paso metabolómica: Hidratos de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos cuantificados en un procedimiento único
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Resumen
Resumen
Cada niño nacido en los EE.UU. es ahora seleccionados para un máximo de 42 trastornos genéticos raros llamados "errores congénitos del metabolismo". El método de detección se basa en la espectrometría de masas y cuantifica acilcarnitinas como una pantalla para acidemias orgánicas, así como las medidas de los aminoácidos. Todos los estados también realizan pruebas enzimáticas para los trastornos de los hidratos de carbono como la galactosemia. Debido a que los resultados pueden ser no específicos, pruebas de seguimiento de resultados positivos es necesario utilizar un método más definitivo. El presente informe describe la "ureasa" método de preparación de muestras para la detección de errores innatos. Enzima ureasa cristalina se utiliza para eliminar la urea de los fluidos del cuerpo que permite que la mayoría de los otros metabolitos solubles en agua para deshidratar y derivado de cromatografía de gases en un solo procedimiento. La deshidratación por evaporación en una corriente de nitrógeno se ve facilitada por la adición de acetonitrilo y cloruro de metileno. Entonces, trimethylsilylation lleva a cabo en la presencia de un catalizador único trifluoroacetato trietilamonio,. Inyección automatizada y es seguida por cromatografía de macro-impulsado cuantificación personalizadas de 192 metabolitos y semi-cuantificación de todos los componentes principales con las bibliotecas especializadas de espectros de masas de compuestos biológicos TMS derivado. El análisis se puede realizar en la plataforma Chemstation ampliamente utilizado con las macros y librerías disponibles por parte del autor. En nuestro laboratorio, más de 16.000 muestras de pacientes han sido analizados usando el método con un rendimiento diagnóstico del 17% - es decir, el 17% de los resultados de las muestras revelan los resultados que deben ser tramitadas por el médico solicitante. Se incluyen en estas más de 180 confirmados errores innatos, de los cuales aproximadamente el 38% no podría haber sido diagnosticado con los métodos anteriores.
Protocolo
Procedimiento para el procesamiento de muestras de orina
- Descongele la muestra de orina en un baño de agua a 37 ° C. Decantar en un nuevo envase si el original está en peligro.
- Tomar una alícuota máxima de 13 ml de muestra y almacenarla a -20 ° C en un tubo de centrífuga cónico de etiquetado.
- Medir y registrar la densidad óptica de la muestra mediante la colocación de un par de gotas de orina en el refractómetro.
- Filtrar la muestra a través de un filtro de 0,2 um.
- Medir el volumen de muestra a continuación de acuerdo a la densidad óptica
1.000-1.009 1,00 ml 1.010-1.019 0,50 ml 1.020-1.050 0,25 ml + 0,25 ml de H 2 O - El volumen específico se transfiere entonces a un Reactivial contiene las siguientes normas internas: 500 nanomoles (nmoles) 3 creatina, 10 nmoles d 3 El ácido metilmalónico, 100 nmoles de cada uno de los siguientes 13 C 3 de lactato, piruvato 3 13 C, 13 C 2 15 N glicina, serina 3 d, d 5 fenilalanina, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotato, d 4 ácido sebácico, 13 C 6 glucosa, inositol y 6 d d 5 triptófano.
- 20 microlitros (l) de un 7,5 unidades / l de solución de ureasa (Calzyme Catálogo de laboratorios no. 116A0100) se añade a la muestra, que es vaciado y sellado en CO 2 a través de un tabique inerte.
- La muestra se lleva a cabo a 37 ° C durante 30 minutos con más gas carbónico añadido a intervalos de 15 minutos para mantener la presión.
- 20 l más de la solución de ureasa, se añade, el frasco se llena con dióxido de carbono, y la muestra se mantuvo a 37 ° C durante 15 minutos.
- 500 l de acetona 30:70: se mezcla con metanol, el tapón de goma se sustituye por un tabique recubierto de teflón, y la muestra se enfría a -20 ° C durante 15 minutos.
- Los sólidos son retirados por centrifugación a 1500 rpm x 10 minutos y luego se decanta en un lugar limpio Reactivial 2,0 cc (Supelco / Sigma)
- Añadir trifluoroacetato trietilamonio (TEA / TFA) (Sigma) como sigue:
- 20 l de 1,00 ml de muestras
- 40 ml de 0,5 ml o menos muestras,
- Rematar con acetonitrilo y de lugar en una corriente de nitrógeno a 70 ° C hasta que el volumen constante se logra (TEA / TFA seguirá siendo) (~ 15 minutos).
- Repita el paso 13, hasta 4 veces hasta que se forma un precipitado (~ 10 minutos cada uno).
- Deje enfriar durante unos 2 minutos. Rematar con cloruro de metileno, teniendo cuidado de hervir, y seco (~ 4:00 minutos).
- Repita el paso 15.
- Añadir MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (térmica Científica) a las siguientes tarifas:
- 150 l de 1,00 ml de muestras
- 200 l de 0,50 ml o menos muestras,
- Cap en una atmósfera de nitrógeno y se incuba a 70 ° C durante 1 hora.
- Traslado al microviales, bajo una atmósfera de nitrógeno, para el análisis de cromatografía de gases / espectrómetro de masas.
- Microviales lugar para la inyección automatizada por el GC Agilent 5975 / TM: temperatura del instrumento son las siguientes: inyector 200 ° C, la interfaz de 250 ° C, horno de 80 º C durante 1 minuto; rampa a 4 º C / minuto 80-130 ° C, rampa 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa de 12 ° C / minuto 200-285 ° C, mantenida durante 10 minutos. Columna: 25 m, 320 micras ID, 0,5 micrones espesor de la película DB-5. Espectrómetro de masas: fuente de 230 ° C, quad 150 ° C, escaneado 50-650 amu a 2,46 lecturas / seg. Solvente demora 3,5 minutos.
Resultados representante
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Discusión
El método de la ureasa (1) ha sido citado 62 veces en la literatura médica con varias modificaciones. Grupo de Matsumoto (2,3) simplificó el procedimiento para el alto rendimiento de cribado neonatal e informó de los resultados de 16.000 pacientes. Kuhara y otros (4-7) han reportado el uso del método en varios casos de diagnóstico de errores innatos y seguimiento. Rhead (8) también confirmó la utilidad del método para el diagnóstico clínico y el seguimiento de los errores innatos. El método ha sido aplicado a la orina de los osos, ratones knock-out, los elefantes y los homogeneizados de moscas de la fruta entera y sus larvas (9). Los medios de cultivo de Cryptococcus antes y después de la mutagénesis dirigida también se analizaron, sin el paso de ureasa (10). El método ha sido aplicado a la evaluación de la nutrición humana en estudiantes de medicina, pacientes con síndrome de Down y demencia veteranos ancianos después de la carga de los sujetos con dosis orales de los aminoácidos triptófano, metionina e isoleucina (11). Los ocho vitaminas B se evaluó mediante la cuantificación de los productos de descomposición de los tres aminoácidos que, entre ellos, requieren que todos los 8 vitaminas en algún momento de su degradación. Los efectos tóxicos de los fármacos y su mitigación mediante el suplemento vitamínico se ha reportado (12). Muestras de líquido amniótico de embarazos con síndrome de Down normal y se analizaron e informaron (13-15).
Divulgaciones
El laboratorio de cribado metabólico es un laboratorio clínico con licencia CLIA propiedad de Saint Louis University, una corporación sin fines de lucro. El Dr. Shoemaker no se benefician directamente de los ingresos de laboratorio, pero podrían beneficiarse indirectamente de la productividad del laboratorio. Ninguno de los métodos, las técnicas, los resultados, los rangos normales, macros, las bibliotecas de software, o las conclusiones se consideran de propiedad y son de libre disposición de los interesados.
Agradecimientos
La asistencia técnica capaz de Anthony Thomas se agradece.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computadora | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computadora | |
| Ureasa | Calzyme | 116A0100 | También Sigma C3 |
| Estándares de Isótopos Estables | CDN Isotopes | ||
| Disolventes | Fisher Scientific | ||
| Analitos | Sigma-Aldrich | ||
| Columnas de GC | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Viales | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
Referencias
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
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- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
Reimpresiones y permisos
