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Este protocolo es un extracto de Tauc et al., Aislamiento de células madre intestinales de Drosophila adulta Midguts por FACS para estudiar el comportamiento de las células madre durante el envejecimiento, J. Vis. Exp. (2014).
NOTA: Si este protocolo se utiliza por primera vez para aislar ISCs mediante la clasificación FAC, los siguientes controles son obligatorios para establecer inicialmente los parámetros FACS correctamente: Células disociadas de intestinos medios de Drosophila de tipo salvaje (por ejemplo, w1118) sin Sytox. Células disociadas del intestino medio de Drosophila de tipo salvaje (por ejemplo, w1118) con Sytox (ver Paso 3.6). Células disociadas del intestino medio de la línea de mosca esg-Gal4, UAS-GFP sin Sytox.
1. Preparación de soluciones y platos para la disección intestinal
- Prepare de 4 a 6 viales que contengan cada uno 40 moscas hembra de la línea de moscas esg-Gal4, UAS-GFP.
- A partir de una solución madre de PBS 10x, prepare 500 ml, 1x PBS (1,8 mM NaH,2PO,4·H2O, 8,4 mM Na,2HPO,4·2H2O, 175 mM NaCl, ajuste el pH a 7,4).
- Prepare una solución de agarosa al 3,5% en 1x PBS (3,5 g de agarosa de grado de electroforesis en 100 ml 1x PBS). Prepare las placas de disección vertiendo esta solución en placas de Petri (diámetro de 8,5 cm) para cubrir el fondo. La capa de agarosa evita dañar las puntas de las pinzas durante el procedimiento de disección. Una vez que el gel se haya solidificado, almacene las placas de disección a 4 °C.
- Prepare 300 ml de 1x PBS + 1% BSA fresco antes de diseccionar y coloque el frasco sobre hielo o a 4 °C.
- Encienda la centrífuga y déjela enfriar a 4 °C.
- Flamea las puntas de 2 pipetas Pasteur de vidrio para alisar los bordes.
- Limpie dos pares de pinzas y una hoja de afeitar con etanol al 70%.
- Coloque de cuatro a seis tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para recoger en hielo los intestinos medios disecados.
2. Preparación del tracto gastrointestinal y disección del intestino medio
- Anestesiar moscas de un vial (40 moscas) con CO2 en un lecho de moscas estándar, decapitar todas las moscas con una cuchilla de afeitar y transferirlas a la placa de disección. Vierta 1 solución fría de PBS/1% BSA en la placa de disección para cubrir el gel de agarosa. Las moscas flotarán.
- Agarra el abdomen de la mosca con un par de pinzas, mientras sostienes el tórax con el otro par de pinzas. Separa el tórax del abdomen. El intestino será visible y lo más probable es que el intestino anterior aún esté conectado al tórax.
- Agarra la tripa y sácala del tórax. Para desplegar la tripa, agarre el buche y tire de la tripa ligeramente hacia atrás del abdomen.
- Agarre el extremo posterior del abdomen con un par de pinzas y el borde de la cutícula abierta anteriormente con el otro par de pinzas. Tenga cuidado de no destruir el tejido intestinal que sobresale. Tire del extremo posterior para romper la cutícula y continúe tirando hacia atrás muy suavemente hasta que todo el intestino se haya extraído de la cavidad abdominal. Es posible que sea necesario retirar el buche de antemano si es demasiado grande para caber a través de la cavidad corporal.
- Extirpar el intestino anterior, los túbulos de Malpighi, el intestino posterior y los ovarios dejando el intestino medio desnudo.
- Con una pipeta Pasteur de vidrio, transfiera el lote de intestinos medios disecados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga una solución fría de 1x PBS/1% BSA y mantenga el tubo en hielo. Las muestras deben procesarse en un plazo de 2 horas.
- Una vez completada la disección de un lote completo, enjuague el plato de disección con agua destilada doble para lavar los residuos sobrantes. Comience a diseccionar el siguiente lote de intestinos medios (repita los pasos 2.1 a 2.7). Diseccione tantos lotes como sea posible dentro de las 2 horas, luego continúe con el Paso 3.1.
3. Digestión del tejido intestinal para recolectar células para la clasificación FAC
- Retire la solución 1x PBS/1% BSA del intestino medio y añada 500 μl de solución de tripsina-EDTA al 0,5% a cada muestra.
- Coloque el pozo en vórtice durante 20 segundos e incube las muestras balanceándolas/girándolas suavemente a 20 rpm a temperatura ambiente durante 25-30 minutos.
- Vuelva a hacer vórtice después de unos 30 minutos y deje que el tejido intacto del intestino medio se hunda hasta el fondo del tubo. Retire con cuidado las células que están en suspensión con una pipeta Pasteur de vidrio flameado y fíltrelas a través de una malla de nailon de 35 μm en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml.
- Centrifugar las celdas a 100 x g durante 5 min a 4 °C. Cabe destacar que, al iniciar la digestión, es posible que una cápsula celular no sea visible al principio, pero se hará visible a medida que avanza la digestión del tejido.
- Transfiera con cuidado la solución de tripsina al tubo de muestra original que contiene el tejido intacto restante del intestino medio. Evite transferir demasiadas células del pellet.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet de celda en 400 μl de 1x PBS/1% BSA frío. Mantenga los tubos de microcentrífuga que contienen las células disociadas en hielo y cubra los tubos con papel de aluminio para proteger las células de la luz.
- Vuelva a colocar la solución de tripsina que contiene el tejido intacto restante del intestino medio y coloque las muestras en el balancín durante otros 30 minutos a temperatura ambiente.
- Repita los pasos 3.3 a 3.4.3 hasta que se haya digerido todo el tejido del intestino medio. Combine las celdas disociadas de todos los tubos de microcentrífuga en un tubo de microcentrífuga. Esto puede requerir una etapa de centrifugación como en el punto 3.4, ya que el volumen de todas las suspensiones celulares combinadas puede exceder 1,5 ml. Mantenga la suspensión celular en hielo y proteja las células de la luz.
- Centrifugar las células disociadas a 100 x g durante 5 min a 4 °C. Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante, dejando aproximadamente 50-100 μl de la solución 1x PBS/1% BSA en el tubo de microcentrífuga. Vuelva a suspender suavemente las células disociadas en 800 μl 1x PBS/1% BSA que contenga Sytox (1:20.000).
- Transfiera la suspensión celular a un tubo Falcon de fondo redondo de 5 ml filtrando las celdas a través de una tapa a presión de filtro celular (malla de nailon de 35 μm). Mantenga siempre las muestras de células en hielo y protegidas de la luz. Las celdas ya están listas para ser ordenadas.
- Pipetear 600 μl de solución de ARNlater en cada tubo de microcentrífuga en el que se clasificarán las células para su posterior aislamiento del ARN. Para otras aplicaciones posteriores, las células se pueden recoger en una solución diferente, por ejemplo, en PBS estéril.