Análisis de la esperanza de vida: medición de la longevidad de C. elegans

Resumen

Fuente: Cornwell, A. B., et al. El Método del Conjunto de Réplicas: Un Enfoque de Alto Rendimiento para Medir Cuantitativamente la Vida Útil de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2018).

Este video describe un método tradicional basado en placas para medir la vida útil de C. elegans. El protocolo de ejemplo mide la vida útil de los gusanos tratados con ARNi.

Protocolo

El siguiente protocolo es un extracto de Cornwell et al, El método del conjunto de réplicas: un enfoque de alto rendimiento para medir cuantitativamente la vida útil de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Prevenir la producción de progenie mediante la adición de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)

1. Cultive los animales hasta la etapa L4 a 20 °C. Verifique si los animales sincronizados han evolucionado a L4 aproximadamente 40 h después de la siembra (paso 2.1.7).
   NOTA: El tiempo de desarrollo de C. elegans variará a diferentes temperaturas y las tasas de crecimiento de los animales mutantes para los que no se han caracterizado las tasas deben ser probadas empíricamente.
   1. Añadir 160 μL de 50x FUdR a cada placa de 6 cm con animales L4.
      NOTA: Es fundamental agregar FUdR en la etapa L4. Para mayor comodidad, prepare 1.000 veces las existencias de FUdR disolviendo 1 g de FUdR en 10 ml de H₂O. Filtre-esterilice la culata FUdR con un filtro de 0,2 μm y una jeringa de 10 cc. Alícuota ~1 mL de stock en tubos estériles de 1,5 mL. Congelar y almacenar a -20 °C.
2. Inspeccione las placas para detectar la presencia de machos de C. elegans. Retire todos los machos.
   NOTA: La esperanza de vida se mide típicamente para los hermafroditas y no para los machos. Los hermafroditas que se aparean viven menos tiempo que los animales no apareados, incluso en presencia de FUdR. Los machos son más pequeños y delgados que los hermafroditas y se pueden identificar fácilmente por una cola ganchuda distintiva.
3. Vuelva a colocar la caja en la bolsa con cierre hermético. Vuelva a la incubadora a 20 °C.

>2. Puntuación de la viabilidad

1. Compruebe la viabilidad diariamente tocando suavemente al animal en la cabeza con un alambre de platino o una pestaña. Marque a los animales que no logran moverse como muertos y retírelos del plato (Figura 1A). Registre el número de muertos observados para cada condición para cada punto de tiempo de observación.
   NOTA: Para reducir el riesgo de sesgo de puntuación, el experimentador debe permanecer ciego a las condiciones experimentales y, de manera similar, no debe hacer referencia a los resultados de puntos de tiempo anteriores durante la puntuación.
2. Censurar a los animales que se rompen, mueren por otros defectos obvios de desarrollo o se arrastran por el costado del plato: elimine estos animales y registre el número en cada punto de tiempo observado para su consideración en el análisis estadístico. Además, si se encuentran machos, retírelos y registre el número observado.
3. Repita desde el paso 2.1 diariamente hasta que no queden animales vivos.
   NOTA: En caso de que el césped de E. coli disminuya significativamente o los hongos comiencen a crecer en el plato, transfiera todos los animales restantes a un plato nuevo con el ARNi y el FUdR adecuados.

Resultados

Figura 1: El método tradicional y el método del conjunto de réplicas para calificar la esperanza de vida de C. elegans (A). El método tradicional para calificar la vida útil de C. elegans. A lo largo del tiempo se realiza un seguimiento de varias pequeñas poblaciones sincronizadas de animales isogénicos por condición. Se sigue a la misma población de a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FuDR (5-Fluoro-2'-desoxiuridina)	Alfa Aesar	L16497
24 Placas de Cultivo de Pozos	Greiner Bio-One	#662102
600 μL placas de 96 pocillos	Greiner Bio-One	#786261
2mL placas de 96 pocillos	Greiner Bio-One	#780286
replicador de placas de 96 pines	Nunc	250520
C. elegans RNAi biblioteca de clones en bacterias HT115- Ahringer	Fuente: Bioscience	Colección de ARNi de C. elegans (Ahringer)	Véase también Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi biblioteca de clones en bacterias HT115- Vidal	Fuente: Bioscience	Recurso ORF-RNAi de C. elegans (Vidal)	Véase también Rual et. al, Genome Research 2004. Esta biblioteca también está disponible en Dharmacon.
L4440 Plásmido Vectorial Vacío	Addgene	Año 1654	https://www.addgene.org/1654/