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El siguiente protocolo es un extracto de Cornwell et al, El método del conjunto de réplicas: un enfoque de alto rendimiento para medir cuantitativamente la vida útil de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
1. Prevenir la producción de progenie mediante la adición de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)
- Cultive los animales hasta la etapa L4 a 20 °C. Verifique si los animales sincronizados han evolucionado a L4 aproximadamente 40 h después de la siembra (paso 2.1.7).
NOTA: El tiempo de desarrollo de C. elegans variará a diferentes temperaturas y las tasas de crecimiento de los animales mutantes para los que no se han caracterizado las tasas deben ser probadas empíricamente.
- Añadir 160 μL de 50x FUdR a cada placa de 6 cm con animales L4.
NOTA: Es fundamental agregar FUdR en la etapa L4. Para mayor comodidad, prepare 1.000 veces las existencias de FUdR disolviendo 1 g de FUdR en 10 ml de H2O. Filtre-esterilice la culata FUdR con un filtro de 0,2 μm y una jeringa de 10 cc. Alícuota ~1 mL de stock en tubos estériles de 1,5 mL. Congelar y almacenar a -20 °C.
- Inspeccione las placas para detectar la presencia de machos de C. elegans. Retire todos los machos.
NOTA: La esperanza de vida se mide típicamente para los hermafroditas y no para los machos. Los hermafroditas que se aparean viven menos tiempo que los animales no apareados, incluso en presencia de FUdR. Los machos son más pequeños y delgados que los hermafroditas y se pueden identificar fácilmente por una cola ganchuda distintiva.
- Vuelva a colocar la caja en la bolsa con cierre hermético. Vuelva a la incubadora a 20 °C.
>2. Puntuación de la viabilidad
- Compruebe la viabilidad diariamente tocando suavemente al animal en la cabeza con un alambre de platino o una pestaña. Marque a los animales que no logran moverse como muertos y retírelos del plato (Figura 1A). Registre el número de muertos observados para cada condición para cada punto de tiempo de observación.
NOTA: Para reducir el riesgo de sesgo de puntuación, el experimentador debe permanecer ciego a las condiciones experimentales y, de manera similar, no debe hacer referencia a los resultados de puntos de tiempo anteriores durante la puntuación.
- Censurar a los animales que se rompen, mueren por otros defectos obvios de desarrollo o se arrastran por el costado del plato: elimine estos animales y registre el número en cada punto de tiempo observado para su consideración en el análisis estadístico. Además, si se encuentran machos, retírelos y registre el número observado.
- Repita desde el paso 2.1 diariamente hasta que no queden animales vivos.
NOTA: En caso de que el césped de E. coli disminuya significativamente o los hongos comiencen a crecer en el plato, transfiera todos los animales restantes a un plato nuevo con el ARNi y el FUdR adecuados.
