C. elegans Ensayo de supervivencia: una prueba de toxicidad a corto plazo

Resumen

Fuente: Possik, E. y Pause, A. Medición de la resistencia al estrés oxidativo de Caenorhabditis elegans en placas de microtitulación de 96 pocillos.J. Vis. exp. (2015).

Este video presenta un ensayo de supervivencia a corto plazo que prueba un tratamiento para la toxicidad aguda o prueba una cepa genética para determinar la resistencia a una condición tóxica. El protocolo de ejemplo muestra un ejemplo de ensayo de supervivencia en el que se evalúa la capacidad de los gusanos para resistir el estrés oxidativo inducido por el paraquat (PQ).

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Possik and Pause, Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates, J. Vis. Exp.(2015).

1. Realización del ensayo de resistencia al estrés oxidativo

1. Pipetear 40 μl de la solución PQ de 100 mM (preparada fresca) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Utilice al menos 12 pocillos como réplicas de cada condición (tratamiento, mutante, etc.). Usando un pico de gusano de alambre de platino, transfiera de 5 a 8 animales de larva L4 a cada pozo indicando la hora de inicio y la hora de finalización.
2. Al iniciar otra condición, tenga en cuenta la hora de inicio y la hora de finalización. Coloque la placa a 20 °C en el tiempo de incubación entre la transferencia de los gusanos y el marcado de los animales muertos una hora después de la hora de inicio.
3. Usando el microscopio de disección, cuente la supervivencia cada hora. Agite suavemente el plato antes de comenzar a contar. Indica los gusanos que no se mueven, incluso después de detectar una luz de alta intensidad, como animales muertos. Indique también el número de animales vivos.
   NOTA: Observar la forma del gusano, la cola y el movimiento de la cabeza a gran aumento, ayuda a determinar los gusanos muertos de los vivos.
4. Repita este paso cada hora hasta que la mayoría de los gusanos estén muertos.

2. Determinación del porcentaje de supervivencia en cada punto temporal

1. Calcule el número total de animales por condición sumando el número total de animales transferidos a cada pozo. Ignore los animales que son dañados o muertos al ser transferidos.
2. Para cada punto de tiempo, calcule el número total de animales muertos por condición (suma de animales muertos en los 12 pozos). Para cada punto de tiempo, calcule el porcentaje de muerte (número de animales muertos dividido por el número total de animales y multiplicado por 100) y el porcentaje de supervivencia (100 menos el porcentaje de muerte).
3. Repita este ensayo al menos 3 veces independientes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio estéreo zeiss Discovery v8	Zeiss
Placa de microtitulación transparente de 96 pocillos