Digestión enzimática y disociación manual: un método para preparar embriones de C. elegans para cultivo celular

Resumen

Fuente: Sangaletti, R. y Bianchi, L. Un método para cultivar células embrionarias de C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Este video presenta un método para aislar y cultivar estérilmente células embrionarias de C. elegans in vitro.

Protocolo

1. Disociación de células embrionarias

1. Realice los siguientes pasos del procedimiento en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar. Mientras que los animales se alimentan con placas de bacterias, los lavados y el tratamiento con la solución de lisis que contiene lejía deberían eliminar la mayoría, si no todas, las bacterias. Por lo tanto, el uso de una campana laminar en este punto del procedimiento evita una nueva contaminación de la suspensión de huevo.
2. Vuelva a suspender los huevos peletizados en 1 ml de 2 mg/ml de quitinasa (caldo en tampón de huevo pH 6,5) y transfiéralos a un nuevo tubo cónico estéril de 15 ml. Agite el tubo durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. El tiempo exacto de incubación cambia según la frescura de la enzima y la temperatura de la habitación y, por lo tanto, debe determinarse para cada preparación. Se recomienda comenzar a monitorear los huevos bajo un microscopio de cultivo celular invertido después de 10 minutos de incubación. Nota: en nuestra experiencia, un pH bajo aumenta la actividad enzimática de la quitinasa. Por esta razón, usamos tampón de huevo a pH 6.5 para disolver la quitinasa (receta informada anteriormente, donde el pH se ajusta a 6.5 usando NaOH).
3. Cuando ~ 80% de las cáscaras de huevo hayan sido digeridas por el tratamiento de quitinasa (Figuras 1 A-B), granule los huevos por centrifugación a 900 x g (~2,500 rpm) durante 3 min. Usando una pipeta P1000 y puntas estériles, retire con cuidado el sobrenadante y agregue 3 ml de medio L-15.
4. Transfiera los huevos a una placa de 6 cm de diámetro y disocie suavemente las células con una jeringa estéril de 10 ml equipada con una aguja de 18 G. Controle el grado de disociación colocando una gota de suspensión en una placa de Petri de plástico nueva y observándola bajo el microscopio. No aspire aire en la jeringa durante este procedimiento para evitar dañar las células. Continúe la disociación hasta que ~ 80% de las células estén disociadas.
5. Filtre la suspensión con un filtro Millipore estéril de 5 μm. Las suspensiones celulares deben filtrarse para eliminar los grupos de células, los huevos no digeridos y las larvas eclosionadas. Filtre 4-5 ml adicionales de medios L-15 frescos a través del filtro para recuperar todas las células. No ejerza una fuerza excesiva durante la etapa de filtración para evitar dañar el filtro y/o las células.

>2. Cultivo de células

1. Granular las células disociadas por centrifugación a 900 x g (~2.500 rpm) durante 3 min. Con una pipeta P1000 y puntas estériles, retire cuidadosamente todo el sobrenadante. Vuelva a suspender las células peletizadas en medio L-15 completo y coloque 1 ml/pocillo. La cantidad de medio añadido depende del número de 8P las placas utilizadas, la confluencia de los gusanos en las placas y el tipo de experimentos que se realizarán en las células. La densidad celular se puede determinar utilizando un hemocitómetro. Para las grabaciones de patch-clamp, la densidad de recubrimiento de ~ 230.000 células/^cm2 es óptima.
2. Mantenga el plato de 24 pocillos en un recipiente de plástico Tupperware que contenga toallas de papel húmedas para evitar la evaporación del medio de cultivo. Guarde el recipiente en una incubadora humidificada a 20 °C y al aire ambiente.
3. Por lo general, las células están listas para los experimentos dentro de las 24 horas, cuando se completan la diferenciación morfológica y la expresión de los marcadores GFP. Las células se pueden mantener en cultivo hasta por 2 semanas, pero generalmente están más sanas hasta 7-9 días después de la siembra. El medio debe reemplazarse una vez al día para mantener las células sanas.

Resultados

Figura 1. Embriones de C. elegans antes y después del tratamiento con quitinasa. (A) Fotografía de los huevos antes de la exposición a la quitinasa. La flecha señala la cáscara de huevo transparente e intacta que rodea a un embrión. (B) Huevos tratados con quitinasa durante 10 min. Las cáscaras de huevo han sido digeridas y ya no son visibles al...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>REACTIVOS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Suero Fetal Bovino	Invitrogen	16140-063
Penicilina-estreptomicina	sigma	P4333-100ML
Quitinasa de Streptomyces Griseus	sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Puntas de pipeta graduadas azules	Aroma de EE. UU	Números 1111-2821
10 ml Pipeta esterilizada envuelta individualmente	Aroma de EE. UU	1071-0810
Pipeta ergonómica de volumen variable (100-1000 μl) con eyector de punta	VWR International Inc.	89079-974
Pipeta Portátil, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Pipeta de Plástico de Transferencia Estéril	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Tubo Cónico	Aroma de EE. UU	1475-1611
Agujas estériles de calibre 18	Becton, Dickinson y Cía.	305196
Jeringas estériles de 10 ml	Becton, Dickinson y Cía.	305482
Filtros de jeringa de plástico Corning 0,20 μm tamaño de poro	Corning	431224
Filtro de jeringa acródico de 25 mm con membrana versapor de 5 μm	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Placa de Petri Estéril	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Placa de Petri Estéril	VWR International Inc.	82050-912
12 mm de diámetro Cubreobjetos de vidrio	VWR International Inc.	48300-560
Placas de Cultivo Celular Transparente Fondo Plano de 24 Pocillos con tapa	Tomás científico	6902A09
Dumont #5- Pinzas Finas	Herramientas de Bellas Ciencias	11254-20
Centrífuga 5702	Eppendorf	22629883
Campana de Flujo Laminar
Microscopio invertido con objetivo x10
Incubadora humidificada por aire ambiente