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Este protocolo es un extracto de Tong et al, Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion, J. Vis. Exp. (2013).
1. Experimento de electrotaxis
- Coloque el microcanal en la platina (preferiblemente móvil XY) de un microscopio con una cámara montada conectada a un monitor (Figura 1).
- Conecte la fuente de alimentación o los cables de salida del amplificador a los electrodos del microcanal. Una simple fuente de alimentación de CC es suficiente si solo se desea una señal de CC, pero un amplificador conectado a un generador de funciones también permite la aplicación de señales de CC y CA pulsadas.
- Conecte el tubo de salida del microcanal a una jeringa desechable. Sumerja la boca del tubo de entrada en el tampón fisiológico M9 y aspire suavemente el líquido en el canal aplicando una presión negativa dentro de la jeringa (ya sea manualmente o utilizando una bomba de jeringa). Cuando los tubos de entrada y salida estén llenos de M9, desconecte la jeringa del tubo. Nivele ambos tubos a la misma altura para evitar el flujo impulsado hidrostáticamente.
- Aplique un voltaje de CC al canal y asegúrese de que la resistencia (R = V / I) sea de alrededor de 0,6 MΩ (para un microcanal de 50 mm de largo, 0,3 mm de ancho y ~0,1 mm de profundidad).
- Si está satisfecho con la integridad del canal, siga los pasos anteriores para cargar gusanos de una suspensión diluida en el canal.
- Desconecte la jeringa y manipule hidrostáticamente el flujo ajustando la altura relativa de los tubos. Use este método para colocar un gusano en el centro del canal y luego coloque ambos tubos planos a la misma elevación.
- Ajuste la fuente de alimentación al voltaje adecuado: 4-12 V/cm para animales de la etapa L3, 4-10 V/cm para L4 y 2-4 V/cm para adultos jóvenes. Activa la señal eléctrica y deja 1 minuto de preexposición para que el gusano se aclimate al campo. El gusano debe comenzar a moverse hacia el cátodo. Cuando haya pasado el minuto, use la cámara para comenzar a grabar.
- Para experimentos de CA y CC pulsada, el campo eléctrico de máxima respuesta se puede adoptar desde arriba y la frecuencia y el ciclo de trabajo de la señal se pueden modular como se desee.
- Una vez finalizado el experimento, retire todo el líquido (y los gusanos) del canal, enjuáguelo con dH20 y deje secar el dispositivo en una placa caliente a 125 °C.
- Extraiga datos locomotores de los vídeos grabados manualmente utilizando NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o software de seguimiento de gusanos personalizado basado en MATLAB.
