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El siguiente protocolo es un extracto de Davies et al, Un ensayo para medir los efectos del etanol en la velocidad de locomoción de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
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Pasos a realizar el día antes del ensayo
- Escoja los gusanos de la etapa L4 en placas frescas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con un césped de E. coli OP50 y cultívelos a 20 °C O/N. Cada condición de ensayo requiere 10 gusanos; elija un exceso de lombrices para permitir la pérdida O/N de lombrices.
- Solo ensaye animales que son adultos de primer día; muchos mutantes crecen a una velocidad más lenta que los de tipo salvaje. Ajuste el momento de la selección de las cepas que tienen retrasos en el desarrollo para que todos los animales analizados sean adultos en el primer día.
- Pasos a realizar el día del ensayo
- Preparación para el ensayo:
- Realice ensayos en placas NGM estándar de 60 x 15 mm sin sembrar. Seque todas las placas que se van a utilizar a 37 °C durante 2 horas, sin tapa. Para cada ensayo experimental, utilice cuatro placas de NGM secas; estas serán las placas de ensayo de etanol de 0 mM y 400 mM y las placas de aclimatación que las acompañan.
NOTA: El uso de placas NGM es importante aquí; Las diferencias en la composición de las placas, en particular su osmolaridad, pueden afectar fuertemente la respuesta a la dosis de etanol en el comportamiento, esto se debe, al menos en parte, a los cambios en la cantidad de etanol acumulada por los animales. El agar NGM es de 160 mOsm.
- Después del secado, pese cada una de las placas NGM sin semillas que se utilizarán en el ensayo y anote el peso. Determine el volumen de medios en las placas en función del peso de una placa vacía. Para aproximar la conversión del peso del agar a volumen, suponga que el medio pesa lo mismo que un volumen igual de agua.
NOTA: Nuestros resultados más consistentes se han encontrado con medios NGM que se han deshidratado lo suficiente como para que un volumen original de 10 ml tenga un volumen posterior al secado entre 8,3 y 8,9 ml. Una alternativa al tiempo de secado de 2 horas es secar hasta que las placas alcancen este rango de volumen para tener en cuenta las diferencias en las incubadoras.
- Fundir 4 anillos de cobre (diámetro interior de 1,6 cm) en la superficie de cada una de las placas para que actúen como corrales para los diferentes genotipos o grupos de tratamiento de lombrices. Agarre cada anillo con pinzas y caliente en una llama (una llama fuerte de un mechero Bunsen funciona bien) durante aproximadamente 3 segundos. Coloque inmediatamente el anillo en un plato mientras sigue sujetando el anillo con las pinzas para evitar que "salte".
- Asegúrese de que el anillo quede plano contra la superficie del agar presionando suavemente con las pinzas en varios puntos del anillo. Al colocar el anillo, tenga cuidado de dejar espacio para tres anillos adicionales.
- Derrita los tres anillos de cobre adicionales en la superficie de la placa, teniendo cuidado de colocarlos lo más juntos posible para que los cuatro estén en el campo de visión de la cámara><.
NOTA: Hacer un buen sellado con el agar es esencial para mantener los gusanos en los anillos durante el ensayo. Es poco probable que los anillos que saltan en la placa hagan el sello correcto con el agar y pueden dejar cicatrices en el agar, lo que permite que los gusanos se entierren e interfiere con la visualización de los gusanos.
- Para cada placa de ensayo, prepare una placa de "aclimatación" que la acompañe, que debe estar seca y sin semillas y no recibirá etanol. Coloque cuatro anillos de cobre en estas placas.
- Etiquete la parte inferior de las placas junto a cada anillo con la cepa de gusano que se utilizará en el anillo, teniendo cuidado de no escribir en el campo de visión del anillo en sí. Haga coincidir las etiquetas de la placa de ensayo con la placa de aclimatación que la acompaña.
- Calcule la cantidad de etanol al 100% que se debe agregar a cada placa de ensayo de modo que la concentración final sea de 0 mM o 400 mM de etanol (peso a volumen). Para cada experimento (n = 1), habrá una placa de etanol de 0 mM y otra de 400 mM; Las placas de aclimatación no reciben etanol. Agregue el etanol, pipeteándolo alrededor de la superficie de la placa. Use una película de laboratorio para sellar la placa y permita que se equilibre en la mesa de trabajo durante 2 horas.
- Cuando haya transcurrido 1,5 horas, comience la etapa de aclimatación del ensayo, paso 2.2.
- Realizar ensayo de locomoción: Placas de ensayo
- Transfiera con cuidado 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en la placa de aclimatación. Retire cualquier alimento que sea visible en el agar en este punto raspando suavemente con el palillo de gusano. Varíe el orden en que los grupos experimentales se colocan en las placas en los ensayos experimentales para que las mismas cepas no se coloquen en las placas en el mismo orden en todos los ensayos.
NOTA: El objetivo es transferir los animales a la placa con cantidades mínimas de comida, porque si la comida de la placa de aclimatación se transfiere a la placa de ensayo, los gusanos se agruparán alrededor de la comida y el efecto del fármaco sobre la locomoción se oscurecerá.
- Tenga cuidado de no romper la superficie del agar con el pico, ya que esto permitirá que los gusanos se entierren e interrumpirá el ensayo. Incuba las lombrices en RT durante 30 min.
- Asegúrese de que haya un intervalo adecuado entre las iniciaciones de cada placa. Un experimentador experimentado puede mover 40 animales, 10/anillo por 4 anillos en < 1,5 minutos, pero cualquier intervalo de hasta 2 minutos es aceptable. El ensayo estándar graba películas a 10-12 min y 30-32 min de exposición para etanol de 0 mM y 400 mM.
- Inicie la placa de aclimatación para la exposición de 0 mM y la placa de aclimatación para la exposición de 400 mM con una separación de aproximadamente 2 min y 30 s para permitir el almacenamiento del primer archivo de película antes de que comience la segunda película.
- Después del período de aclimatación de 30 minutos, transfiera los gusanos de las placas de aclimatación a las placas de ensayo. Transfiera los gusanos a las placas de ensayo (0 mM o 400 mM de etanol) en el mismo orden en que se agregaron a la placa de aclimatación, realizando un seguimiento del tiempo entre las terminaciones de cada placa. Selle la placa con una película de laboratorio para minimizar la pérdida de etanol por vaporización.
- Use un movimiento de cuchara con un pico de gusano aplanado de borde delgado para recolectar gusanos encima del pico aplanado. Realice la transferencia de lombrices desde la placa de aclimatación sin semillas a la placa de ensayo sin el uso de bacterias, que se usa comúnmente en la transferencia de lombrices, ya que ayuda a pegar la lombriz al pico.
NOTA: La velocidad a la que se transfieren los animales en este paso es muy importante porque los primeros gusanos en la placa estarán expuestos al etanol durante más tiempo que los últimos gusanos agregados a la placa, y los puntos de tiempo anteriores pueden mostrar algunos efectos dependientes del tiempo. Esta es la razón principal para rotar las cepas que se colocan primero en una placa a través de las réplicas experimentales.
- Realizar ensayo de locomoción: filmación
- Utilice una combinación de microscopio y cámara que permita obtener imágenes simultáneas de los cuatro anillos en el campo de visión (aproximadamente 42 x 42 mm2 cuadrados), como un objetivo de microscopio de 0,5x, un aumento de 0,8 x y una cámara con un CCD de píxeles de 7,4 μm de 2048 x 2048.
- Utilice una iluminación uniforme en todo el campo de visión, lo que ayuda a reconocer objetos en el paso del umbral de intensidad. Una retroiluminación de 3"x3" funciona bien.
- Visualice los gusanos en una placa colocada con el lado del medio hacia arriba (tapa hacia abajo), lo que genera un contraste que se pierde cuando se usa la luz de fondo en comparación con una fuente de luz transmitida por microscopio tradicional.
- Prepare el software de análisis de imágenes para capturar videos de lapso de tiempo de los gusanos en movimiento. Configure el software para capturar imágenes en escala de grises de 12 bits cada 1 segundo, como una película de 2 minutos (120 fotogramas). Para reducir el tamaño del archivo de salida, sin dejar de conservar una resolución de imagen suficiente, utilice un modo de agrupación de 2x2 para capturar imágenes de 1024x1024 píxeles.
- Graba las películas. Comience a grabar una película de 120 fotogramas de la primera placa (etanol de 0 mM) 10 minutos después de que se colocaron los últimos gusanos en esa placa. Guarde el archivo de película.
- Registre la segunda placa (400 mM de etanol). Repita este proceso para ambas placas comenzando 30 minutos después de que se colocaron los últimos gusanos en la primera placa (etanol de 0 mM) para capturar los puntos de tiempo de 30 a 32 minutos para cada exposición.
NOTA: Deje tiempo suficiente para guardar los archivos de imagen después de cada sesión de captura antes de comenzar la grabación de la siguiente placa que se va a analizar.
- Para garantizar el futuro de las películas archivadas y permitir que estas películas sean abiertas y analizadas por otros programas de software de imágenes de código abierto de dominio público, como ImageJ, convierta una copia de cada película en archivos TIFF de 8 bits y 256 en escala de grises><.
NOTA: El software de análisis de imágenes descrito aquí utiliza un formato de archivo propietario.