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Abstract

Fuente: Palanca A. M. S., et al. Activación optogenética de neuronas somatosensoriales de pez cebra usando ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (2013).

Este video describe técnicas optogenéticas mediante la activación de neuronas somatosensoriales modificadas genéticamente y el registro de la respuesta conductual provocada con una cámara de video de alta velocidad.

Protocol

1. Montar larvas para experimentos de comportamiento

1. Prepare un 1,5% de agarosa de bajo punto de fusión en ddH2O y almacene en un bloque de calor a 42 °C para evitar que se solidifique.
2. Con una pipeta Pasteur de vidrio, transfiera una de las larvas preseleccionadas a un tubo de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% con la menor cantidad posible de agua azul/embrionaria.
3. Transfiera las larvas en una gota de agarosa a una pequeña placa de Petri.
4. Bajo un microscopio de disección, coloque la larva dorsal hacia arriba.
5. Cuando la agarosa se haya solidificado, córtela con una cuchilla de afeitar delgada (bisturí # 11), dejando una rodaja de agar alrededor de toda la larva.
6. Haz dos cortes diagonales a cada lado de la yema; ten cuidado de no cortar la larva.
7. Llene el área que rodea la agarosa con embrión/agua azul.
8. Separe la agarosa del tronco y la cola de la larva (Figura 1).

2 . Prepare la cámara de alta velocidad y el software de imágenes

1. Monte la cámara de alta velocidad en el visor de disección.
2. Conecte la cámara a la computadora.
3. Encienda la computadora.
4. Encienda la cámara de alta velocidad.
5. Software abierto de video/imágenes (Usamos software de imágenes AOS y describiremos los procedimientos para usarlo aquí, pero otro software de imágenes es igualmente aceptable).
6. Ajuste la configuración de la cámara en consecuencia (es decir, 1.000 fotogramas por segundo (fps), 50% de búfer de disparo u otras configuraciones preferidas).
7. Empieza a grabar.

<p class="jove_title">3. Activar neuronas individuales usando un láser de 473 nm

1. Conecte el estimulador, el láser y el cable óptico.
2. Enciende el estimulador.
3. Ajuste el estimulador a un máximo de 5 voltios y una duración de pulso de 5 mseg.
4. Encienda el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Utilice un microscopio de disección para posicionar la punta del cable óptico cerca del cuerpo celular de una neurona con expresión de ChEF-tdTomato (Figura 1).
6. Emite pulso de luz azul para activar la neurona sensorial.
7. Grabe el comportamiento con una cámara de alta velocidad configurada a 500 o 1.000 fotogramas por segundo.
8. Repita el experimento según lo desee, esperando 1 minuto entre cada activación para evitar la habituación. (Registramos un mínimo de tres respuestas para cada neurona).
9. Para liberar las larvas, separe la agarosa con pinzas, teniendo cuidado de no lastimar al animal. Se puede permitir que este animal se desarrolle más y el procedimiento se puede repetir en una etapa más avanzada para caracterizar el desarrollo del comportamiento. El embrión también se puede volver a montar para obtener imágenes confocales de alta resolución de la célula activada para correlacionar el comportamiento con la estructura celular, como se describe a continuación.
10. Transfiera la larva a la placa de cultivo con agua fresca azul/embrionaria. Utilizamos una placa de 24 pocillos para realizar un seguimiento de las larvas individuales.

Representative Results

Materials

Low Melt agarose 	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100×15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent