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1. Montar larvas para experimentos de comportamiento
- Prepare un 1,5% de agarosa de bajo punto de fusión en ddH2O y almacene en un bloque de calor a 42 °C para evitar que se solidifique.
- Con una pipeta Pasteur de vidrio, transfiera una de las larvas preseleccionadas a un tubo de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% con la menor cantidad posible de agua azul/embrionaria.
- Transfiera las larvas en una gota de agarosa a una pequeña placa de Petri.
- Bajo un microscopio de disección, coloque la larva dorsal hacia arriba.
- Cuando la agarosa se haya solidificado, córtela con una cuchilla de afeitar delgada (bisturí # 11), dejando una rodaja de agar alrededor de toda la larva.
- Haz dos cortes diagonales a cada lado de la yema; ten cuidado de no cortar la larva.
- Llene el área que rodea la agarosa con embrión/agua azul.
- Separe la agarosa del tronco y la cola de la larva (Figura 1).
2 . Prepare la cámara de alta velocidad y el software de imágenes
- Monte la cámara de alta velocidad en el visor de disección.
- Conecte la cámara a la computadora.
- Encienda la computadora.
- Encienda la cámara de alta velocidad.
- Software abierto de video/imágenes (Usamos software de imágenes AOS y describiremos los procedimientos para usarlo aquí, pero otro software de imágenes es igualmente aceptable).
- Ajuste la configuración de la cámara en consecuencia (es decir, 1.000 fotogramas por segundo (fps), 50% de búfer de disparo u otras configuraciones preferidas).
- Empieza a grabar.
>3. Activar neuronas individuales usando un láser de 473 nm
- Conecte el estimulador, el láser y el cable óptico.
- Enciende el estimulador.
- Ajuste el estimulador a un máximo de 5 voltios y una duración de pulso de 5 mseg.
- Encienda el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice un microscopio de disección para posicionar la punta del cable óptico cerca del cuerpo celular de una neurona con expresión de ChEF-tdTomato (Figura 1).
- Emite pulso de luz azul para activar la neurona sensorial.
- Grabe el comportamiento con una cámara de alta velocidad configurada a 500 o 1.000 fotogramas por segundo.
- Repita el experimento según lo desee, esperando 1 minuto entre cada activación para evitar la habituación. (Registramos un mínimo de tres respuestas para cada neurona).
- Para liberar las larvas, separe la agarosa con pinzas, teniendo cuidado de no lastimar al animal. Se puede permitir que este animal se desarrolle más y el procedimiento se puede repetir en una etapa más avanzada para caracterizar el desarrollo del comportamiento. El embrión también se puede volver a montar para obtener imágenes confocales de alta resolución de la célula activada para correlacionar el comportamiento con la estructura celular, como se describe a continuación.
- Transfiera la larva a la placa de cultivo con agua fresca azul/embrionaria. Utilizamos una placa de 24 pocillos para realizar un seguimiento de las larvas individuales.
