Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Nuestro objetivo es poner a prueba la redundancia funcional de dos factores de transcripción para la especificación de los progenitores de los cardiomiocitos. Los factores son codificados por dos genes relacionados con GATA5 y GATA6 y estamos utilizando el modelo de pez cebra para comprender sus funciones en relación ^1. Nuestra estrategia es bloquear la función de genes usando morfolinos ^2. Vamos a inyectar morfolinos para uno u otro gen en huevos fertilizados, y comparar el fenotipo embrionario con embriones derivados de óvulos inyectados simultáneamente con morfolinos. Para simplificar la evaluación de los fenotipos, usamos huevos derivados de pescado que llevan a un transgén que expresa las buenas prácticas agrarias en los cardiomiocitos.

Paso 1. Preparación para la microinyección.

A) El establecimiento de parejas reproductoras de los peces

La noche antes de la inyección, los peces las mujeres solteras que hombres y solo para adultos (3-18 meses de edad) se colocan en pares en los tanques de reproductores separados por un divisor hasta la mañana siguiente. Por lo general establecido 10-20 pares de los peces, y estos se aparean una vez a la semana, independientemente de si los huevos se utilizan, para mantener la fecundidad. Para este experimento se utiliza una cepa reportera, transgénicos para cmlc2: EGFP, ya que proporciona una lectura simple de identificar a los cardiomiocitos de diferenciación. A la mañana siguiente, una vez que las luces están encendidas, el agua se cambia, y los divisores son extraídos de los tanques que permite los pares de los peces para reproducirse y producir huevos. La producción de huevos se puede controlar, y puede iniciar de inmediato, o tras un período de una hora o más, dependiendo de los peces. Normalmente, después de aproximadamente 20 minutos sin interrupción del apareamiento, los huevos son recolectados a través de una pipeta o un colador y se vierte en 100 mm placas de Petri que contiene el agua del sistema. Es importante controlar la producción de huevos para asegurar que los embriones se inyectan entre la etapa de células 1-4. Por la liberación de varias parejas a la vez, es posible escalonar la producción de huevos y así maximizar la cantidad de huevos que se puede inyectar en una etapa temprana de desarrollo. Un buen par de peces puede generar más de 200 embriones, y no tiene ningún sentido práctico para recoger miles de huevos al mismo tiempo, ya que un solo investigador que no sería capaz de inyectar la suficiente rapidez antes de que desarrollen más allá de la fase de 4 células . Los peces son estimuladas a reproducirse en el ciclo de luz, así que esto es un experimento que requiere un inicio temprano, y los huevos no se obtienen generalmente después del mediodía.

B) Preparación de las agujas

1. Use un extractor Micropipeta y un 3,5 "tubo capilar de vidrio para generar dos agujas con las siguientes condiciones: calor = 626, Tire = 60, Velocidad = 60, y la hora = 250 Utilizamos agujas núcleo abierto que no contienen un filamento, porque. les delante de llenado por succión.
2. La punta de cada aguja se rota suavemente con una hoja de afeitar limpia o con pinzas, y, posteriormente, biselado a un ángulo de 30 grados durante unos 20 segundos utilizando una amoladora micro-EG-4. Es cada vez más la punta y es importante si se inyecta a través del corion.
3. Es importante para obtener un diámetro constante aguja tamaño de la punta de alrededor de 15 micras (calibrado de 4 unidades con un ocular de microscopio cuadriculada, para poder calibrar el volumen de 1-2 nl inyección).
4. Las agujas deben ser preparados de antemano, están almacenados en un lugar seguro, y cada uno se calibra individualmente justo antes de iniciar las inyecciones para asegurar un volumen de inyección constante (véase la sección D para más detalles). Si usted es afortunado, usted puede ser capaz de usar una sola aguja de un experimento. Sin embargo, una aguja puede romper fácilmente en medio de un experimento, y usted no quiere usar ese tiempo para sacar agujas nuevas.

C) Hacer que las placas de la inyección

1. Preparar 100 ml de una solución al 2% de agarosa en el sistema de agua, mediante ebullición en un horno de microondas.
2. Frío al tacto, y se vierte sobre 12 ml en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 mm.
3. Inserte dos portaobjetos de microscopio, inclinado a unos 45 grados de los ángulos, en los dos lados de la tapa. Una vez que la agarosa se ha solidificado, tire suavemente de las dos diapositivas de distancia de la tapa.
4. Esto crea canales donde los embriones se colocan y se inyecta posteriormente. Varias planchas se pueden preparar con anticipación. Pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° C después de añadir una capa de etanol al 70%, agregando que la parte inferior de la placa original, sellado con parafilm. Recuerde lavar bien antes de usar.

D) Microinyección estación de calibración y la aguja

1. Encienda la fuente de nitrógeno comprimido y microinyector PLI-100. El inyector debe ser ajustada para una presión de flujo constante de 18 PSI.
2. Antes de la inserción de una aguja, asegúrese de que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir una amplia gama de movimiento, y que una aguja insertada no se enciende la mesa. Inserte uno delas agujas preparado anteriormente (véase la sección C) en el micromanipulador asegurándose de que haya un sello hermético. Tenga cuidado de no romper la aguja.
3. Observar la punta de la aguja en el microscopio para asegurarse de que no esté obstruido antes de proceder a la calibración.
4. Coloque una gota (2.3 l) de solución inyectable o _ddH2O en un pequeño trozo de parafilm y rellenar alrededor de 1,5 l tirando de él hacia la aguja con el botón de relleno. Asegúrese de que usted tiene la punta de la aguja completamente en la solución, y observar la succión de líquido a través del microscopio para evitar llamar en cualquier burbuja de aire.
5. Coloque una gota de aceite mineral en la red de un micrómetro.
6. Ajustar empíricamente el momento de la inyección para asegurar que el tamaño de la gota es de aproximadamente 1,5 micras de diámetro. Para ello destinará un volumen de inyección de ~ 1,8 nl. El volumen real se puede ajustar a su elección, pero en un sentido práctico, es difícil calibrar con precisión los volúmenes por debajo de 1 nl, y los embriones no pueden tolerar volúmenes por encima de 2 nl. Independientemente del tamaño del volumen que usted elija, que sea el mismo para todas las inyecciones, incluidos los controles y ajustar la concentración de la solución (en lugar del volumen de inyección) para valorar la cantidad de producto morfolino.
7. Recalibración es necesaria cada vez que se sustituye la aguja, ya que los tamaños de punta de la aguja puede variar.

Paso 2. Validación de morfolinos enfocada a dos genes distintos

Morfolinos están diseñados para tratar el sitio de iniciación de la traducción o en los sitios de empalme de un ARNm diana, bloqueando así la síntesis de proteínas o de procesamiento de ARNm adecuado. Cuando se analiza un gen por primera vez, se utiliza dos tipos de morfolinos para probar si generan el mismo fenotipo, lo que indica una caída en específico. Una de las ventajas del empalme-bloqueante es que se puede verificar la caída de la transcripción de lo normal por RT-PCR, que es especialmente útil si los anticuerpos para el gen de interés no están disponibles. Vamos a ilustrar cómo un fenotipo cardíaco constante se logra por la GATA5 y GATA6 genes con morfolinos (GATA5 5'UTR secuencia MO: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; GATA5 sitio de empalme MO secuencia: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; Gata6 5 'UTR MO secuencia: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

1. Morfolinos se obtienen de Gene Herramientas, LLC (Philomath, OR). Herramientas Gene le ayudará a elegir la mejor secuencia de destino, si le preguntas a su personal de apoyo. Sólo es necesario para enviar el número de registro, y aconsejan voluntad. Sin embargo, no hay garantía de que el morfolino va a funcionar, por lo que usted necesita estar preparado para validar la actividad. También puede comprobar si el morfolino está disponible en OpenBiosystems. Herramientas gen ofrece reservas de morfolinos sintetizado a OpenBiosystems. Aunque de nuevo no hay garantía de que funcione, que venden pequeñas cantidades a un costo menor, lo que puede ayudar a sufragar los costos para las pruebas de nuevos objetivos. Asegúrese de que su morfolino BLAST contra el transcriptoma, que utilizar la función de Blat en el navegador UCSC genoma del pez cebra (genome.ucsc.edu). Por supuesto, si un morfolino ha sido validada (rigor) en la literatura, se recomienda que usted compra la misma secuencia.
2. El morfolino se disuelve en agua estéril ddH ₂ 0 a una concentración final de 1 mM y se almacena a temperatura ambiente. No congelar las soluciones morfolino, como por alguna razón, las bajas temperaturas a veces puede ocasionar que agregan y precipitan. Morfolinos son insensibles a las proteasas o nucleasas, así que mientras el agua se agrega es estéril, debe ser bastante segura a temperatura ambiente.
3. Antes de inyectar, se incuba la morfolino a 65 ° C durante 5 minutos para asegurar que se disuelva por completo, y dejar enfriar a temperatura ambiente. No se debe colocar la muestra en hielo. Mantenga el morfolino a temperatura ambiente hasta la inyección.
4. Para titular una morfolino, que suelen preparar diluciones seriadas de la concentración de valores en ddH ₂ 0 para dar concentraciones de trabajo de 1 mm, 0,5 mm, 0,25 mM y 0.125 mm. Dependiendo de la secuencia, con 1,8 nl de volumen de inyección, lo que representa aproximadamente 20ng, 10ng, 5 ng, y 2.5ng de morfolino por inyección. Esto es sólo un punto de partida, ya que la tolerancia y la eficacia de cada morfolino pueden variar y no se puede predecir. La mayoría de morfolinos no será tolerado por mucho superiores a 20 ng, pero algunos pueden ser efectivos en dosis muy por debajo de 1 ng. Nuestro enfoque consiste en definir la concentración en la que un fenotipo "mesetas". En otras palabras, si un fenotipo definido, no es visto con 2,5 ng, pero es similar con una cantidad igual o superior a 5 ng, elegiríamos 5 ng como un monto mínimo. Por supuesto, podría ser útil para valorar la próxima entre 2,5 ng y 5.0 ng, para asegurarse de que están trabajando de forma reproducible más allá del umbral, en lugar de la derecha "en la frontera".
5. Llene la aguja y calibrado(Ver más arriba) con la concentración más baja de trabajo (más diluida) morfolino solución. Evitar el exceso de llenado de la aguja, ya que simplemente será un desperdicio de material. Si se llena sólo una l, no es solución suficiente para 500 inyecciones.
6. Con una pipeta desechable, la transferencia de una célula fertilizada a los embriones en las depresiones de la placa de microinyección. Retire el exceso de agua para asegurarse de que los embriones se precipitan al fondo de los valles de la inyección. No debe flotar, sino que más bien se adhieren a la cama de agarosa.
7. Coloque la placa de la inyección para que el micromanipulador puede descender la punta de la aguja a través del corion y en la yema de inyección. Para colocar los embriones individuales, manipular la placa de inyección de tal manera que la punta de la aguja de inyección empuja o tira de los embriones en la posición correcta. Tenga cuidado de no romper la punta de la aguja o embriones de daños! Esto requiere cierta práctica, pero por regla general se utiliza el micromanipulador simplemente para mover la aguja de inyección en el embrión y luego después de la inyección, en lugar de forma rápida y limpiamente a cabo. Los embriones se ponen en posición de inyección, moviendo el plato con la mano libre (la izquierda si se inyecta con la mano derecha). Para un estudiante nuevo, es útil para practicar el uso de una solución que contiene 0,25% de rojo fenol en el fin de visualizar la solución inyectada. La confianza es también obtuvo mediante la inyección de una solución que contiene microesferas fluorescentes etiquetados (Molecular Probes, F-8794), para confirmar que la solución se inyecta en el embrión, en lugar del espacio entre el corion. Sin embargo, después de unas cuantas rondas de práctica, estas ayudas son por lo general ya no es necesario. Es una buena idea de vez en cuando se inyectan en el aire, sólo para confirmar que la aguja no esté obstruido y que el volumen que se inyecta parece apropiado.
8. Embriones inyectados se transfieren a una placa de Petri de 100 mm con sistema de agua y se cultivaron a 28.5C. Después de la inyección de la concentración mínima de servicio, la solución restante puede ser expulsado y el siguiente más alta concentración de trabajo de morfolino utilizado para rellenar la aguja. Repita este procedimiento para cada concentración de morfolino. A pesar de que es posible aclarar el agua con la aguja, al probar una clara morfolino, preferimos cambiar las agujas y recalibrar. Asegúrese de mantener una cohorte de embriones inyectados para verificar si el lote específico de los embriones era sano y normal.

Paso 3. Co-inyección de morfolinos en dosis umbral individual

El objetivo de la valoración realizada anteriormente fue definir un umbral de dosis para cada morfolino. En el mejor de los casos, prácticamente el 100% de la morphants mostrará un fenotipo definido, si el gen diana tiene una función esencial. Sin embargo, usted puede esperar cierta variabilidad debido a los artefactos de inyección mal. Con la práctica, esto no debería superar el 10%. Algunos lotes de embriones (incluyendo los controles no inyectados) no puede sobrevivir así, en cuyo caso el experimento puede ser necesario con descuento. Por otra parte, también existe la variabilidad biológica, ya que los embriones individuales pueden ser más o menos tolerantes a la caída. Por último, algunos morfolinos no puede ser sólo lo suficientemente eficiente para lograr un sólido (penetrante) caída. Si un fenotipo se genera en un bajo porcentaje de embriones, pero se puede reproducir, puede valer la pena probar una distinta morfolino. El objetivo de este experimento siguiente es determinar si un fenotipo completamente nuevo se ve cuando ambos genes están dirigidos al mismo tiempo. No estamos simplemente buscando un aumento en el porcentaje de embriones que tienen un fenotipo morphant, sino más bien para la generación de un fenotipo distinto que no se ve por encima del nivel del umbral cuando se prueba uno de los genes individuales.

1. Prepare una mezcla de la combinación de morfolinos probado con anterioridad, en el umbral de concentración de cada individuo morfolino que generó un fenotipo definido. Por ejemplo, si el umbral para cada gen fue de 5 ng, preparar una solución de trabajo que contiene 5 ng + 5 ng de cada uno (un total de 10 ng). Puesto que los embriones no pueden tolerar mucho más que 20 ng morfolino total, es importante, sobre la base de los experimentos anteriores, para utilizar la cantidad mínima de cada uno, que es suficiente para focalizar eficientemente cada gen.
2. Los controles deberán incluir conjuntos de embriones inyectados con cada individuo solo morfolino en la misma concentración que se utilizó para la combinación. Los volúmenes de solución inyectable debe mantenerse constante (por ejemplo, 1,8 nl). Una gran ventaja de utilizar una cepa periodista es que se puede evaluar el fenotipo (por ejemplo, la diferenciación de cardiomiocitos) en cualquier momento, y en repetidas ocasiones. Si los embriones deben ser evaluados para la expresión de genes por hibridación in situ, la etapa de concordancia embriones y los controles se puede fijar en varias ocasiones después de la inyección. Para nuestro experimento, vamos a evaluar la expresión de GFP como un sustituto para la diferenciación de los cardiomiocitos, aproximadamente a las 24 HPF.

Paso 4. Evaloración de los fenotipos

1. Embriones inyectados deben ser controlados, justo después de la inyección, y varias veces durante el día, para eliminar los embriones muertos o moribundos, ya que estos pueden poner en peligro la viabilidad de la morphants restantes. Para evaluar la expresión del gen reportero, los embriones son examinados con un microscopio de disección equipado con la capacidad de fluorescencia. Nosotros usamos un microscopio Nikon SMZ1500, con un objetivo 1X o 1.6X y un rango de magnificación de 0,75 x a 11.25x. Cuando se utiliza un filtro fluorescente, asegúrese de abrir el diafragma a la configuración totalmente abierta para maximizar la intensidad de la luz. También asegúrese de usar el filtro correcto, dependiendo del gen reportero (GFP, RFP, etc.)
2. Los embriones son típicamente sedado utilizando una dilución de 1 / 20 en el sistema de agua de las acciones de 4mg/ml metanosulfonato tricaína. Las existencias se almacenan congeladas a-20C. Por otra parte, los embriones pueden ser sacrificados con el stock de 20x tricaína. Los embriones pueden ser examinados por lo general, aunque todavía se encuentran en el corion. Sin embargo, especialmente si se va a fotografiar, es una buena idea para eliminar el uso de fórceps coriones fuerte. Los embriones pueden ser vistos después de colocar en las diapositivas de la depresión en la solución tricaína, o mejor inmovilizarlos para la fotografía colocada en una pequeña gota de un 3% de metilcelulosa.
3. Observar los fenotipos de embriones en los inyectados con la combinación de morfolinos en comparación con morphants sola. Aquí estamos buscando el patrón de expresión de GFP en el tubo cardíaco primitivo. En este reportero GFP cepa se expresa exclusivamente en los cardiomiocitos a través del promotor cmlc2, lo que permite un análisis detallado de las especificaciones y la morfogénesis cardíaca tubo cardíaco.

Resultados representante

En nuestra experiencia, tanto en el GATA5 y GATA6 morphants solo muestran reproducible fenotipos cardíacos cuando se inyecta con los niveles de umbral, aunque existe una considerable variabilidad biológica ^3,4. Por ejemplo, la mayoría de los GATA5 morphants generar un corazón bífida, con expresión de las buenas prácticas agrarias ubicadas en dos regiones. Esto se debe a que los progenitores cardíacos no pueden migrar correctamente a fusionarse en la línea media durante la formación del corazón del tubo. Sin embargo, algunos de los GATA5 morphants generen un tubo de corazón defectuoso, y en un pequeño número (5%) se observa una disminución significativa en la cantidad de células GFP +. Creemos que esto refleja la variabilidad biológica, pero también puede ser debido al hecho de que morfolinos no son equivalentes a un "null" mutación.

Asimismo, la Gata6 morphants todos muestran un fenotipo cardíaco, pero hay una serie de fenotipos que incluye un pequeño número de bífido se calienta, y los corazones que son morfológicas alterado en comparación con el control de los embriones inyectados. Esta variabilidad no es raro que un fenotipo cardíaco morfogenéticos, desde la formación del corazón es un proceso dinámico y por lo menos algunos de los fenotipo cardíaco puede deberse indirectamente a partir de embriones defectos morfogenéticos. Sin embargo, lo más importante, la gama de defectos cardíacos morfogenética de morphants tanto GATA5 y GATA6 es consistente y reproducible, y la mayor parte de los embriones de generar importantes GFP + cardiomiocitos.

En marcado contraste con la GATA5 y GATA6 morphants solo, agotado embriones de ambos factores muestran una pérdida completa de la expresión de GFP, en consonancia con la pérdida de cardiomiocitos. Por lo tanto, GATA5 y GATA6 cada uno tiene no redundante funciones de la morfogénesis cardíaca, pero los dos genes son funcionalmente redundantes en un requisito para la generación de cardiomiocitos diferenciados. Nuestros estudios anteriores mostraron también una pérdida de los primeros marcadores de cardiomiocitos, incluyendo Nkx2.5, lo que sugiere un requisito para la especificación de cardiomiocitos ^3.