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1. Generación de Mamósferas Primarias a partir de Líneas Celulares de Cáncer de Mama Humano
NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de cultivo estéril.
- Prepare Mammosphere Media que contenga DMEM/F12 suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina. Prepare el medio completo inmediatamente antes de usar añadiendo 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF; Sigma), 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos recombinantes (bFGF; R&D Systems) y 1x suplemento B27.
- Aspire los medios de un matraz que contenga células MCF-7 o MDA-MB-231 adherentes (o una línea celular de cáncer de mama de su elección; 70-80% de confluencia), lave dos veces en 1x PBS y tripsinice las células.
- Centrifugar las células a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 1-5 ml de medio de mamografía. Pipetear hacia arriba y hacia abajo y, si es necesario, utilizar un filtro de tapón de filtro de celdas de 40 μm para obtener una suspensión de una sola celda. Use un hemocitómetro para asegurarse de que se haya formado una suspensión de una sola célula (si no, use una aguja de 25 G para jeringar la suspensión celular hasta 3 veces).
- Si es necesario, aislar el subconjunto celular CD44+CD24- mediante FACS utilizando anticuerpos monoclonales anti-CD24-ficoeritrina (PE) y anti-CD44-fluoresceína isotiocianato (FITC)9. Alternativamente, aísle dicha población utilizando un sistema de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) con microperlas combinadas anti-CD44 y anti-CD24-biotina según las instrucciones del fabricante. Realice la selección positiva mediante columnas LS y la selección negativa mediante columnas LD y confirme los fenotipos de todas las células aisladas mediante citometría de flujo.
- Calcule el número de células viables por ml usando azul de tripán.
nota: La viabilidad celular se calcula como el número de células viables dividido por el número total de células dentro de las rejillas del hemocitómetro. Las células que absorben el azul de tripano se consideran inviables. El siguiente procedimiento se utiliza para determinar con precisión la proporción de células viables.
- Prepare una solución al 0,4% de azul de tripano en PBS. Añadir 0,1 ml de solución madre de azul de tripano a 1 ml de células. Cargue un hemocitómetro y examínelo inmediatamente bajo un microscopio a bajo aumento. Cuente el número de células totales y el número de células de tinción azul. Celdas viables = [1.00 – (Número de celdas azules ÷ Número de celdas totales)] × 100.
- Para calcular el número de células viables por ml de cultivo, utilice la siguiente fórmula. Recuerde corregir el factor de dilución.
Número de células viables × 104 × 1,1 = células/ml de cultivo
- Vuelva a suspender una cantidad predeterminada de células en 2 ml de medio de mamosfera completo en cada pocillo de una placa de adherencia ultrabaja de 6 pocillos. La densidad de siembra es normalmente de 500-4.000 células/cm2 celdas por pocillo. Opcionalmente, utilice placas de 24 pocillos de fijación baja mientras siembra las células a la misma densidad en 0,5 ml de media.
nota: Recomendamos optimizar la densidad de siembra y el tiempo de cultivo para cada línea celular de interés.
- Incubar placas de 6 pocillos de ultra baja adherencia a 37 °C y 5% deCO2 durante 5-10 días (dependiendo de la línea celular y del tamaño de las mamósferas) sin alterar las placas, especialmente durante la fase de crecimiento de los primeros 5 días.