Transducción para marcar células tumorales PDX: introducción de un marcador fluorescente que expresa lentivirus en la célula tumoral in vitro

En este artículo

Resumen

Fuente: Hanna, C., et al. Etiquetado de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama con reporteros trazables para estudios de crecimiento tumoral y metástasis. J. Vis. Exp. (2016).

El siguiente video describe una técnica de transducción para marcar (xenoinjertos derivados del paciente) células tumorales PDX, que se utiliza para introducir lentivirus que expresan proteína verde fluorescente y reporteros de luciferasa en la célula tumoral in vitro.

Protocolo

1. Transducción de células tumorales derivadas de PDX

Centrifugar las células tumorales disociadas a 300 g x 5 min y resuspender en un medio de mamosfera de 2 ml. Cuente las células viables utilizando la exclusión de azul de tripán (resuspenda las células digeridas en un tampón de lavado de 5 ml y cuente las células viables y no viables utilizando la exclusión de azul de tripano. Brevemente, mezcle 50 μl de células y 50 μl de azul de tripán y cuente el azul de tripán, excluyendo las células, con un hemocitómetro).
Prepare 10 ml de medio para mamosfera que contenga 8 μg/ml de polibreno (2 μl de polibreno madre por ml de medio).
Determine el volumen necesario para 2 x 10⁵ células tumorales viables. Centrifugar las celdas a 300 x g durante 5 minutos y resuspender el pellet en 2 ml de medio que contenga poliBreno. Placa de 2 x 10^{5 células} tumorales viables por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de ultra baja adherencia de 6 pocillos.
nota: Este es un número óptimo de células necesarias para la transducción con un vector lentiviral.
¡cautela!Las partículas lentivirales y todos los consumibles utilizados con partículas lentivirales deben manipularse siguiendo los procedimientos institucionales para los riesgos biológicos del ADN recombinante.
nota: La transducción lentiviral de células mamarias primarias favorece fuertemente a las células mioepiteliales, lo que puede resultar en un etiquetado deficiente de las células luminales y una selección de subpoblaciones de células tumorales durante el etiquetado.
Incubar el virus con 200 mU/ml de neuraminidasa a 37 °C durante 1 hora antes de la transducción para aumentar la unión de las partículas virales a diferentes subpoblaciones de células primarias y corregir este posible sesgo.
Agregue partículas lentivirales a 10 MOI (2 x 10⁶ UT para 2 x 10⁵ celdas viables) si las células disociadas de PDX se agotan de las células de ratón Lin+ o se enriquecen en células EpCam+. Agregue partículas lentivirales a 30 MOI (6 x 10⁶ TU para 2 x 10⁵ celdas viables) si usa celdas disociadas de PDX no enriquecidas.
nota: El aumento del MOI permite una transducción eficiente incluso en presencia de grandes cantidades de residuos y células muertas en los extractos crudos. Mantenga uno bien con celdas no marcadas para que sirva como control de viabilidad y eficiencia de transducción.
Gira para mezclar el virus con las células. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante un máximo de 96 horas. Añadir 500 μl de medio de mamosfera fresco 24 horas después de la transfección. Las celdas no se adhieren a las placas, no aspiran los medios.

2. Evaluación de la eficiencia de la transducción y la reimplantación de células marcadas en ratones inmunocomprometidos

Monitoree la expresión del marcador trazable (GFP) cada 24 horas utilizando un microscopio fluorescente con un aumento de 10X.
nota: La expresión de GFP se puede observar tan pronto como 24 horas después de la infección, pero en la mayoría de las PDX, la expresión de GFP es claramente visible después de 72 horas (Figura 1).
Estimar la eficiencia de la transducción evaluando el porcentaje de células GFP+ dentro del pozo total.
nota: Dado que los cultivos contienen células tumorales, células estromales residuales y células muertas en varios grados, se pueden implantar pocillos con tan solo un 10% de células GFP+ en un ratón huésped.
Transfiera las células transducidas de placas de 6 pocillos a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 1 ml de medio de mamosfera al pocillo para recolectar todas las células que quedan. Colocar sobre hielo.
Añadir 10 ml de HBSS/hepes a las células transducidas y centrifugar a 300 x g durante 5 min, 4 °C. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender en 50 μl de extracto de matriz basal (BME) en hielo.
nota: Las alícuotas de BME deben descongelarse en hielo, 1 a 2 horas antes de su uso. El BME se solidificará a temperatura ambiente; Manténgalo en hielo en todo momento.
Cargue las células incluidas en BME en una jeringa de insulina de 0,5 ml, manténgalas en hielo y llévelas al animalario para su reimplantación en ratones NSG.

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Resultados

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Figura 1: Seguimiento de la eficiencia de la transducción en células PDX disociadas. A) Células disociadas de PDX enriquecidas para células epiteliales humanas (depleción de Lin+) 24 horas después de la transducción con partículas lentivirales pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) Células disociadas de PDX de un experimento separado, sin enriquecimiento de células epiteliales, 72 horas después de...