Cultivo conjunto de células BC: cultivo de células de cáncer de mama con fragmentos óseos para estudiar la proliferación de células cancerosas

Resumen

Fuente: Templeton, Z. S., et al. Métodos para cultivar explantes de tejido de fémur humano para estudiar la colonización de células de cáncer de mama del nicho metastásico. J. Vis. Exp (2015).

Este video describe el cultivo de células de cáncer de mama adyacentes a explantes óseos de fémur para medir la proliferación y colonización de células cancerosas en un sistema modelo de explantes de tejido óseo humano.

Protocolo

1. Co-cultivo de células de cáncer de mama adyacentes a fragmentos óseos para medir la proliferación de células mamarias mediante BLI

1. Antes del experimento, prepare una suspensión que contenga 2 x 10⁵ células de cáncer de mama/50 μl, y prepare tapones de cera ósea para inmovilizar fragmentos óseos en cultivo. Corte la punta de una micropipeta P200 en 3 trozos y utilice el extremo estrecho de la pieza más grande en forma de "cortador de galletas" para cortar trozos pequeños (~35 mg) de cera ósea. Use el extremo ancho de la pieza más pequeña para expulsar los tapones de cera ósea en una placa de Petri para almacenarlos.
2. Coloque un trozo de cera de hueso en la posición de las 12 en punto de cada pocillo y presione suavemente con un dedo índice con guantes estériles.
3. Pipetea 50 μl de suspensión celular que contiene 1 x 10⁵ células de cáncer de mama en DMEM-10% FBS + Pen-Strep en el centro de cada pocillo de una placa de 6 pocillos. (Alternativamente, células semilla en un patrón disperso si lo desea). Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 45 minutos para promover la adhesión celular.
4. Coloque 1 fragmento de hueso en 1 pieza de cera de hueso para cada pocillo experimental y aplique una presión suave con el rongeur para asegurarlo. Realice experimentos por triplicado de modo que 3 fragmentos de hueso de una muestra de THR dada se coloquen en los tres pocillos superiores, mientras que los tres pocillos inferiores contienen cera ósea solo como controles.
5. Con una pipeta de 5 ml, administre suave y lentamente 5 ml de DMEM-10% FBS al costado de cada pocillo para evitar el desplazamiento de las células mamarias o los fragmentos óseos. Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 20-24 horas.
6. Para realizar la obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI), retire la placa de la incubadora y agregue sustrato de luciferina (para lograr una concentración de 300 μg/ml) a cada pocillo. Visualice la placa inmediatamente en una plataforma de imágenes IVIS utilizando los siguientes parámetros: f-stop de 1, agrupación pequeña, tiempo de exposición de 1 segundo, nivel D. Mida la intensidad de la señal de cada pocillo como radiancia promedio (fotones/segundo/centímetro cuadrado/esteradiano).
7. Utilice el software de imágenes para definir las regiones de interés (ROI) y cuantificar la radiancia media de todos los pozos experimentales y de control. Exporte los valores de radiación promedio a una hoja de Excel para realizar estadísticas y generar gráficos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Tecnologías de la Vida	10569-010	Complemente todos los DMEM con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de pluma/estreptococo
Suero fetal bovino	Tecnologías de la Vida	16000-044
Penicillen Estreptomicina	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122
D-luciferina luciérnaga, sal de potasio 5 g (30 mg/ml)	Tecnologías de la Vida	L-8220
6 Clúster de cultivo celular tratado con TC	Corning Incorporado	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Herramientas de Bellas Ciencias	16021-14
Cera de hueso	Corporación de Especialidades Quirúrgicas	903
Plataforma de imagen IVIS 50	Calibrador de Ciencias de la Vida/PerkinElmer
Células de cáncer de mama MCF-7	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 células de cáncer de mama	ATCC	HTB-26