Medio Condicionado de Órganos: Medio Generador de Células de Órganos Recolectadas para Estudios de Cáncer Metastásico

Resumen

Fuente: Piaseczny, M. M., et al. Generación de medios condicionados por órganos y aplicaciones para estudiar las influencias específicas de órganos en el comportamiento metastásico del cáncer de mama. J. Vis. Exp.(2016).

Este video describe un método para generar un medio condicionado por órganos derivado del hígado de ratón. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y estudiar los factores solubles derivados de órganos y sus efectos sobre el tropismo de órganos y el comportamiento metastásico de las células cancerosas.

Protocolo

1. Generación de medios condicionados para los pulmones y el cerebro

1. En una campana de cultivo de tejidos estéril, invierta tres veces los tubos de PBS que contienen pulmón o cerebro para eliminar la sangre residual de los órganos y aspirar la sangre que contiene PBS. Repita con PBS fresco y frío hasta que la solución parezca clara sin evidencia de sangre.
2. Coloque los pulmones y el cerebro en placas de Petri de vidrio separadas de 60 mm2. Con dos hojas de bisturí estériles, pique los pulmones o los cerebros cortándolos repetidamente hacia adelante y hacia atrás hasta que los fragmentos de tejido tengan un tamaño aproximado de ~ 1 mm3.
3. Determine la cantidad de medios necesarios para resuspender los fragmentos de tejido a partir de la diferencia de peso calculada.
   nota: El peso del tejido pulmonar y cerebral se normaliza mediante resuspensión en una proporción media:tejido de 4:1 (vol/peso).
4. Vuelva a suspender los fragmentos de tejido en el volumen adecuado (determinado previamente en el paso 1.3) del medio Weldecco's Modified Eagle (DMEM):F12 suplementado con 1x suplemento concentrado de mitógenos y penicilina (50 μg/ml)/estreptomicina (50 μg/ml).
5. Agregue fragmentos de pulmón o tejido cerebral resuspendidos a un pocillo de una placa de 6 pocillos.
6. Incubar los fragmentos de tejido en medios durante 24 horas a 37 °C y 5% de CO2. Después de la incubación, recoja los medios acondicionados para cada tejido y diluya aún más añadiendo tres volúmenes equivalentes de medios frescos en un tubo cónico de 50 ml.
7. Centrifugar a 1.000 x g en medios acondicionados diluidos para cada órgano a 4 °C durante 15 min para eliminar los restos de tejido de gran tamaño. Recoja el sobrenadante del medio y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
8. Agrupar medios condicionados de cada órgano (es decir, pulmón con pulmón y cerebro con cerebro) de varios ratones para tener en cuenta la variabilidad de ratón a ratón. Alícuota y almacene los medios acondicionados a -80 °C hasta su uso.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x Solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher Scientific	10010-023	Mantener estéril
Placas de Petri de vidrio de 60 mm2	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Mantener estéril
DMEM:F12	Tecnologías de la Vida	21331-020	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar, mantener estéril
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122	Mantener estéril
Tubos cónicos de 50 ml	Termo Científico (Nunc)	339652	Mantener estéril
Filtros de jeringa de 0,22 μm	Sigma-Aldrich	Z359904	Mantener estéril
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Termo Científico (Nunc)	140675	Mantener estéril
Hojas de bisturí	Fisher Científico	S95937A	Mantener estéril