门户静脉注射：研究癌症转移肝脏的方法

Overview

此视频描述了通过门户静脉注射将乳腺肿瘤细胞输送到穆林肝脏的外科手术。该模型允许研究肝转移的后期阶段。

Protocol

1. 手术区和仪器的准备

1. 在计划手术前 10 分钟、1 - 2 天，在 124 °C 的高压下自动切割，准备剪刀、钳子和造势器。确保获得自动切割或无菌床上用品、笼子和手术后恢复的食物。
2. 准备一个无菌手术区，最好是在层压流动罩。
   1. 用 10% 漂白剂擦拭手术区的所有表面，包括加热垫、光源、麻醉管和鼻锥，以及手术套件的任何其他部分，在手术过程中将靠近手术室。
   2. 在无菌手术区，将清洁的加热垫与无菌窗帘，光源，麻醉管和鼻锥，胰岛素注射器，1毫升注射器，布皮瓦卡因， 人工泪液、无菌盐水、2×2"无菌纱布海绵、4×4"无菌纱布、止血纱布切成0.5-1 cm2片、剪刀、钳子、止血剂、4-0维格里尔缝合针和50ml 2%氯西丁葡萄糖酸盐在高压容器中。
   3. 确保在这个空间里有空间存放在冰上准备的肿瘤细胞。
   4. 在手术区旁边的长凳上，用第二个加热垫和带无菌床上用品的清洁笼子准备恢复区。
      注： 这个区域还可以容纳物品，如珠子消毒器。

2. 门户静脉注射

1. 在计划注射前一小时，用100微克0.015毫克/毫升丁丙诺啡（皮下）治疗8至15周的Balb/c雌性小鼠，进行疼痛管理。
   注： 此注射协议可应用于任何年龄的雌性或雄性小鼠菌株，使用适当的细胞系来改变菌株。
2. 根据选择的细胞系或肿瘤解释的方案准备肿瘤细胞注射。在给管前测试所有肿瘤细胞系，以检测粘氨酸病原体的存在，以降低将此类病原体引入动物群落的风险。
   1. 对于包括D2A1、D2.OR和4T1肿瘤细胞在内的合成Balb/c肿瘤细胞系，在注射前3天将细胞解冻成10厘米的组织培养板，以便第二天细胞处于~90-100%的汇合度。
   2. 1天后肿瘤细胞解冻洗涤细胞一次与1x磷酸盐缓冲盐水（PBS），并尝试用2毫升0.05%的三氯苯酚在37°C的5分钟合成共体肿瘤细胞。加入 8 毫升完整介质（DMEM 高葡萄糖、10% 胎儿牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 1x 青霉素/链霉素），然后通过 1：10 放入新鲜的 10 厘米菜中，配有 10 毫升完整介质。
   3. 在注射当天，用 1 倍 PBS 清洗细胞一次，并尝试如上所述的尝试。
   4. 在 8 毫升的完整介质中恢复尝试性细胞，在 1，500 x g 时旋转 5 分钟，取出介质，在 5 毫升 1x PBS 中恢复。
   5. 使用尝试盘蓝色排除在血细胞仪上计数细胞以进行可行性评估。以预先确定的浓度和体积，以 1 倍 PBS 重新注入细胞。
      注： 建议注射量较小的5 -10 μl，以防止对肝脏造成不必要的损害。
   6. 在注射期间将细胞放在冰上。注射完成后，将细胞样本返回实验室，并在完整的介质中放置1天，以确保存活能力。
3. 将小鼠置于麻醉下，用氧气输送2-2.5%异氟兰（2-氯-2-（二氟甲氧）-1，1，1-三氟-乙烷）。使用加热垫保持体温。 通过评估对脚趾捏的反应，确保完全麻醉，然后保持麻醉在2 - 2.5%异氟兰。
   注： 在整个过程中，必须监测动物的呼吸速率并相应地调整异氟兰流速率。
4. 在每个眼睛上放置少量人工撕裂或兽医软膏，以避免在外科手术期间眼睛过度干燥。
5. 将鼠标置于仰卧起亚的位置，放在其背部，腹部暴露。
6. 通过用化学去皮擦拭区域，将啮齿动物的腹腔左侧的头发从第二根肋骨空间移到第 4 个腹腔乳腺。让脱毛者坐1-2分钟，然后用纱布和H2O完全去除。如果计划进行多次手术，可以提前 1 - 2 天完成此步骤，以节省时间。
7. 服用一个2×2"无菌纱布海绵（浸泡在2%氯海西丁），并在脱毛部位擦拭鼠标。消毒整个周围区域，包括尾部，以尽量减少仪器的细菌污染。
8. 用酒精准备垫擦拭脱毛部位和周围区域。
9. 重复 2% 氯西丁和酒精步骤再次，并完成与最终氯西丁擦拭共三个 2% 氯西丁和两个酒精准备垫洗涤。做最后的氯西丁擦拭，使化学物质不会滴在手术部位周围，以避免在内脏上获得氯西丁。
   注： 将大量的氯西丁和酒精应用于皮肤和周围的毛皮可能导致体温显著下降。在步骤 2.7-2.9 期间，不要用超额体积擦拭。用加热垫保持体温。
10. 使用无菌手套和带无菌刀片的消毒手术刀，在小鼠左侧的中位平面和下垂平面之间切入一个 1 英寸的切口，从肋骨正下方开始，到第四个腹膜乳腺奶嘴平面正上方结束。
11. 使用高压灭菌或珠子消毒剪刀和钳子，使类似的1英寸切口进入围产区。避免切入乳腺脂肪垫，并确保不切肠、肝脏或隔膜。
12. 将浸泡在无菌盐水中的 4 x 4" 纱布垫放在小鼠的左侧，在那里切口，使内部器官可以放置在纱布上，不会接触周围的皮肤或手术区域。
13. 准备肿瘤细胞通过管道上下几次肿瘤细胞将定居在准备小鼠。用肿瘤细胞准备25μl可拆卸针注射器和32口径针头。按注射器，直到肿瘤细胞在针尖，柱塞在适当的体积注射：避免注入气泡。
14. 用无菌酒精垫擦拭针外，去除任何外部肿瘤细胞。小心避免用针头。
15. 将切口的中位侧（包括皮肤和腹膜衬里）放在钳子一边，使用无菌棉签小心地将大大小小的肠子拉出，放在浸泡在无菌盐水中的无菌纱布上。拔出大大小小的肠子，直到门户静脉被可视化。
16. 覆盖盐水浸泡纱布中的内部器官，以保持内部水分和不育。
17. 有一个助手，也戴着无菌手套，拿着包裹在盐水浸泡纱布的肠子轻轻地用无菌棉尖拭子，以充分揭示门户静脉。此外，可能需要使用高压灭菌器或钳子将组织放在切口的中间侧。
18. 将装有肿瘤细胞的针头插入入口静脉~10毫米以下，角度=lt;5°到静脉，斜面朝上。慢慢注入含有肿瘤细胞的全体积。允许血液流过针头几秒钟，以避免肿瘤细胞从静脉回流。注射期间，将静脉中的针头移动最小化。同样，请小心避免使用针头。
    注： 门户静脉的可视化无需放大，但如果愿意，可以使用立体显微镜。
19. 取出针头，同时在静脉上放置无菌棉尖施用器，承受压力。助手仍然把肠子放在一边，在静脉上的注射部位放置一块0.5 -1 cm2的止血纱布。
    注： 血态粉末也尝试在协议的这一步骤，但未能有效地阻止注射后静脉失血。
20. 在注射部位用无菌棉尖施用器的压力保持止血纱布 5 分钟。
21. 通过小心地抬起止血纱布来评估静脉的闭合，如果纱布粘在周围的组织上，少量的无菌盐水可用于浸泡和提升纱布。
22. 如果此时发生失血，请在现场放置一块额外的止血纱布，压力为 5 分钟。当血流完全停止时，从鼠标中取出纱布。
    注： 必须仔细评估外科手术期间的失血情况，如果符合或超过允许的失血总量（根据调查员机构审查委员会的监管标准操作程序），小鼠必须在麻醉期间通过心脏灌注进行安乐死。
23. 一旦注射部位被认为完好无损，没有血液离开注射部位，将内脏器官轻轻地放回腹腔。
24. 使用简单的连续或中断的缝合模式，用无菌的 4-0 vicryl 缝合和锥形针缝合腹膜衬里，然后用皮肤缝合。通常，关闭切口需要 10-15 个缝合线。
25. 沿切口部位注射100μl的布皮瓦卡因（5毫克/毫升），使用胰岛素注射器进行局部疼痛管理。使用 1 毫升注射器和 26 口径针头皮下注射 0.5 毫升无菌盐水。手术需要15-25分钟才能完成。
26. 要在整个手术过程中保持无菌状态，请确保所有与小鼠接触的工具和材料，包括戴手套的手，在接触前都得到适当的清洁。如果可能，使用无菌材料和手套，或最小使用 70% 乙醇溶液或 10% 漂白液进行清洁。
27. 如果计划进行多次手术，用新鲜的无菌窗帘重拍初始手术区域， 胰岛素注射器，1毫升注射器，无菌盐水，2 x 2"无菌纱布海绵，4×4"无菌纱布，止血纱布切成0.5 - 1 cm2件，4-0维格里尔缝合与锥形针，和2%氯西丁。在手术之间对剪刀、钳子和造影机进行珠子消毒，并允许在重复使用前充分冷却。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery