Inflado de tinta china: un método de tinción para visualizar nódulos tumorales

Resumen

Fuente: Paschall, A. V. et al. Un modelo ortotópico de ratón de metástasis espontánea de cáncer de mama. J. Vis. Exp. (2016).

Este video describe la inflación de tinta china, un método de tinción, para cuantificar nódulos tumorales en pulmones de ratones portadores de tumores. Después de la tinción, los pulmones se fijan en la solución de Fekete para observar los nódulos tumorales en los pulmones.

Protocolo

>1. Validación de metástasis pulmonares mediante inflado con tinta china de pulmones portadores de tumores

NOTA: Para validar los resultados de las imágenes de tumores vivos con luciferasa, realice el inflado con tinta china de los pulmones de ratones portadores de tumores para cuantificar los nódulos tumorales. Las células 4T1 también hacen metástasis a otros órganos y tejidos (Figura 1) y, por lo tanto, se debe realizar un examen histológico de estos órganos para validar la metástasis tumoral si es necesario. Este protocolo utiliza la metástasis pulmonar como ejemplo.

1. Mantenga a los ratones en su jaula doméstica existente para la eutanasia. Cuando se alojen con otros animales, reubique a los ratones que no están siendo sacrificados a una jaula diferente.
2. Retire la parte superior del filtro de jaula y reemplácela con la parte superior del filtro de CO2. Encienda el cilindro de gas CO2 comprimido (100%) que está conectado a la parte superior del filtro de CO2. Ajuste el caudal a 2 L/min y mantenga el CO2 encendido durante al menos 10 minutos. Si los ratones siguen respirando al cabo de 10 minutos, deje el CO2 encendido hasta al menos 1 minuto después de que los ratones dejen de respirar. Apague el control del cilindro de CO2 y el medidor de flujo. Espere 3 minutos más y retire la parte superior del filtro.
3. Coloque el ratón sacrificado boca arriba sobre un tablero de poliestireno. Sujete las patas con alfileres para asegurar un acceso sin obstrucciones a la tráquea. Rocíe los ratones con etanol al 70%.
4. Con unas tijeras, corta a lo largo de la línea media de la mitad del abdomen del ratón a través de la caja torácica y hacia las glándulas salivales. Observa la tráquea. Use fórceps para extraer los tejidos que rodean la tráquea para exponer la tráquea.
5. Pase la punta de una pipeta por debajo de la tráquea. Sosteniendo la punta con una mano, levante suavemente la tráquea hacia arriba y lejos del cuerpo.
6. Gire la plataforma que sujeta el ratón 180°. Utilice una jeringa de tuberculina de 1/2 CC 27 G 1/2 para inyectar tinta china (10% de tinta china y 0,1% de hidróxido de amonio) en los pulmones a través de la tráquea. Infla completamente los pulmones con tinta hasta que se sienta una fuerte resistencia.
7. Usa unas tijeras para cortar la tráquea. Use fórceps para sujetar el ratón e inserte otro juego de pinzas debajo de los pulmones y saque los lóbulos pulmonares del ratón. Enjuague los pulmones brevemente en un vaso de precipitados que contenga agua.
8. En una campana de gases químicos, transfiera los pulmones a un frasco de centelleo de vidrio que contenga 3 ml de solución de Fekete (50% de etanol, 6% de formaldehído y 3% de ácido acético glacial). Tape el vial para evitar que la solución se evapore.
   nota: Los tejidos pueden almacenarse en la solución de Fekete indefinidamente.
9. Después de unos minutos, observe los nódulos tumorales como puntos blancos en los pulmones negros (Figura 1). El nódulo tumoral blanco es visible a simple vista. Transfiera los pulmones a un plato en una campana extractora y cuente el número de manchas blancas. Cada mancha blanca representa un solo nódulo tumoral metastásico.

Resultados

Figura 1. Visualización de nódulos tumorales de pulmón mediante inflado de tinta china. El pulmón del ratón portador de tumores se infló con tinta china y se fijó en la solución de Fekete. Los puntos blancos son metástasis pulmonares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aplicador AutoClip de 9 mm	Becton Dickinson Diagnóstico de Atención Primaria. Chispas, MD	427630
Tijeras de disección de punta afilada	pescador	8940
Disección de pinzas de punta fina	pescador	8875
70% Etanol	Ultrapure-usa.com
Jeringa de tuberculina 1/2 CC 27 G 1/2	Becton Dickinson y compañía Nueva Jersey	305620