Ensayo de formación de colonias de agar blando: un método para probar los efectos de nuevos compuestos en la proliferación de células cancerosas

Resumen

Fuente: Horibata A. et. al., Utilización del ensayo de formación de colonias de agar blando para identificar inhibidores de la tumorigénesis en células de cáncer de mama. J. Vis. Exp. (2015).

Este video describe un ensayo de formación de colonias de agar blando para probar los efectos de un inhibidor de la enzima PADI y BB-Cl-amidina en la tumorigénesis del cáncer de mama in vitro. Este ensayo también permite la evaluación cuantitativa del potencial de transformación celular en el contexto de las perturbaciones genéticas.

Protocolo

1. Preparación de 2-hidroxietilagarosa al 3%

1. En un frasco de vidrio limpio y seco de 100 ml, agregue 0,9 g de 2-hidroxietil agarosa (Agarosa VII) seguido de 30 ml de agua destilada.
2. Calienta la mezcla en el microondas durante 15 segundos y revuelve suavemente. Repite este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarosa se disuelva por completo.
3. Esteriliza en autoclave el frasco que contiene la solución durante 15 min.
4. Deje que la solución de agarosa se enfríe a RT antes de usarla posteriormente. Almacene la solución en RT.

2. Preparación de la capa inferior: gel de agarosa al 0,6%

1. Precalentar varias pipetas de 5 ml y 10 ml en una incubadora a 37 °C para evitar que la agarosa se solidifique en la pipeta durante la manipulación.
2. Afloje parcialmente la tapa de la botella y cocine en el microondas la solución prefabricada de 2-hidroxietil agarosa al 3% durante 15 segundos. Luego, agite suavemente la solución y cocine en el microondas durante otros 15 seg.
   cautela: Tenga cuidado al agitar la solución de agarosa porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede derramarse.
3. Si hay residuos de gel sólido en la botella, calienta en el microondas durante unos segundos más.
4. Mantenga el frasco que contiene la solución de agarosa en un baño de agua a 45 °C durante los siguientes pasos para evitar que la solución de agarosa se solidifique prematuramente.
5. Calentar los medios de MCF10DCIS en un baño de agua a 37 °C.
   nota: MCF10DCIS medio consiste en DMEM/F12, 5% de suero de caballo, 5% de estreptomicina de penicilina.
6. Transfiera 3 ml de la solución de agarosa al 3% utilizando las pipetas precalentadas a un tubo cónico estéril de 50 ml.
7. Agregue inmediatamente 12 ml de medio de MCF10DCIS tibio e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarosa con el medio. Trate de no formar burbujas, ya que interferirá con el conteo de colonias más adelante.
8. Agregue suavemente 2 ml de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos sin formar burbujas de aire.
9. Incubar la placa de cultivo de 6 pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a 4 °C durante 1 hora para permitir que la mezcla se solidifique.
10. Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos. La capa inferior ya está lista para su uso.

3. Preparación de la capa que contiene células: Gel de agarosa al 0,3%

1. Tripsinizar MCF10DCIS células y diluirlas hasta una concentración celular de 4 x 10⁴ /ml.
2. Tome 2 ml de agarosa al 3% con pipetas precalentadas y transfiéralas a un tubo cónico estéril de 50 ml.
3. Añada inmediatamente 8 ml de MCF10DCIS medio al tubo cónico e invierta suavemente para mezclar la agarosa con el medio. Evite formar burbujas.
4. Tome 2 ml de las células MCF10DCIS (4 x 10⁴ /ml) y trátelas con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
5. En una dilución 1:1, mezcle las células con la agarosa al 0,6%.
6. Tome 1 ml de la mezcla de células y agarosa y añádala suavemente a la capa inferior de la placa de cultivo de 6 pocillos (2 x 10⁴ células/ml).
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a 4 °C durante al menos 15 minutos para permitir que la capa superior se solidifique.
8. Una vez que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante una semana antes de agregar la capa de alimentación.

4. Preparación de la capa de alimentación: gel de agarosa al 0,3%

1. Calienta en el microondas la solución prefabricada de 2-hidroxietil agarosa al 3% durante 15 segundos, agita suavemente la solución y calienta en el microondas durante otros 15 segundos.
2. Equilibrar el frasco de solución de agarosa en un baño de agua a 45 °C.
3. Calentar el medio MCF10DCIS en un baño de agua a 37 °C.
4. Mezcle 1 ml de solución de agarosa al 3% con 9 ml de medio de MCF10DCIS caliente en un tubo cónico de 50 ml e invierta suavemente para mezclar la agarosa con el medio. Evite formar burbujas de aire.
5. Trate la mezcla con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
6. Agregue suavemente 1 ml de esta mezcla (sin formar burbujas) en cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene las capas inferior y suave.
7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a 4 °C durante al menos 15 minutos para permitir que la mezcla se solidifique.
8. Después de que la capa de alimentación se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 °C.
9. Repita este procedimiento de alimentación semanalmente superponiendo 1 ml de solución de agarosa/medio/tratamiento al 0,3% sobre la capa de alimentación existente para reponer las células con nuevos medios hasta que se observe la formación de colonias.
   nota: El agar en las capas blanda y alimentadora es muy suave y, por lo tanto, los nutrientes agregados de la capa alimentadora se difundirán fácilmente en la capa que contiene células para llegar a las células.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Zeiss Axiopot	Microscopía Carl Zeiss	1021859251
Microscopio invertido	Olimpo	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Suero Equino	Fisher Científico	SH30074.03
Penicilina Estreptomicina	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122
2-Hidroxietilagirasa: Tipo VII, baja temperatura de gelificación	Sigma-Aldrich	39346-81-1