Inyección de venas de cola: un método para administrar células cancerosas para estudios metastásicos en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Warren et. al., Uso combinado de ensayos de metástasis de venas de cola e imágenes in vivo en tiempo real para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe una técnica de inyección de células cancerosas marcadas mediante inyección de venas de cola en un modelo de ratón. Además, monitorizamos la formación y el crecimiento del cáncer de mama mediante imágenes de animales vivos in vivo en tiempo real.

Protocolo

1. Inyección en la vena de cola de células cancerosas marcadas

NOTA: El paso 1.2.4 se ha optimizado para células 4T1 que crecen en ratones BALB/c singénicos. Si se utilizan otras líneas celulares cancerosas y cepas de ratones, primero se debe optimizar el número de células inyectadas y la duración del ensayo.

1. Expanda las líneas celulares 4T1 generadas en el paso 2 en dos placas de 15 cm en un medio de crecimiento completo para que las células sobrantes estén disponibles el día de la inyección.
2. Prepare las células para la inyección de la vena de cola de la siguiente manera:
   1. Aspire el medio y enjuague las placas de celda con 1x PBS.
   2. Tripsinar las células con 5 mL de tripsina por placa de 15 cm durante 2-5 minutos (las células deben enjuagarse libremente del fondo del pocillo). Transfiera todas las células a un tubo cónico. Lave las células restantes de la placa de cultivo de tejidos con suficiente medio de crecimiento completo para apagar la tripsina y agregue el lavado al mismo tubo cónico.
   3. Cuente las celdas utilizando un contador de celdas automatizado para determinar el número total de celdas.
   4. Centrifugar las células a 122 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1x PBS a la concentración deseada. Aquí, se inyectan 2,5 x 10⁴ células en cada ratón en 100 μL de PBS, por lo que las células de resuspensión a 2,5 x 10⁵ células/mL. Mantenga las suspensiones celulares en hielo hasta la inyección.
      NOTA: es importante limitar la cantidad de tiempo entre la tripsinización de las células y la inyección de la vena de cola a aproximadamente 1 hora.
3. Inyecte las células 4T1 del paso 1.2.5 en ratones a través de la vena lateral de la cola de la siguiente manera:
   1. Trabajando en una capucha en el animalario, mezcle suave pero completamente las células invirtiendo el tubo o usando una jeringa de 1 ml para asegurarse de que se resuspendan uniformemente. Asegúrese siempre de que las células se resuspendan antes de cargar la jeringa.
   2. Cargue una jeringa Luer-lock de 1 mL con suspensión de celdas y expulse el exceso de burbujas de aire. Coloque una aguja de calibre 30 de 1/2 pulgada en la jeringa con el bisel hacia arriba y expulse las burbujas de aire.
   3. Coloque suavemente al ratón en un protector para roedores.
   4. Las venas laterales de la cola deben ser visibles y dilatadas. De lo contrario, pellizque suavemente la base de la cola y sumerja la cola en agua tibia del grifo para dilatar las venas.
      nota: La dilatación de las venas también se puede lograr colocando la jaula del ratón debajo de una lámpara térmica y/o encima de una almohadilla térmica.
   5. Usa una toallita con alcohol para limpiar la cola. Inserte la aguja en la vena de la cola, con el lado bisel hacia arriba, e inyecte 100 μL de suspensión celular.
      nota: Si la aguja se inserta correctamente en la vena, debe deslizarse fácilmente ligeramente hacia adelante y hacia atrás, y no debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo. Las inyecciones exitosas también deben resultar en un "enrojecimiento" en el que el color azul de la vena se vuelve blanco durante unos segundos después de la inyección.
4. Retire lentamente la aguja y, con una gasa estéril, aplique presión en el lugar de la inyección para detener el sangrado.
5. Regrese el mouse a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Los ratones deben ser examinados para detectar signos de dolor o angustia 3 veces por semana.
6. Monitorizar ratones para determinar la formación y el crecimiento de metástasis durante 3-6 semanas (dependiendo de la línea celular y de la cepa del ratón) utilizando un dispositivo de imagen de animales vivos in vivo (ver pasos 1.5 y 1.6).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2.5% Tripsina	Gibco	15090-046	Tripsina para el cultivo de tejidos
Toallitas con alcohol			Para esterilizar el lugar de la inyección antes de las inyecciones de las venas de cola
Ratones BALB/C (hembras, 6 semanas)	Taconic	BALB-F	Para la colonización metastásica de la vena de cola y los ensayos de carga
Dulbecco&39; S solución salina tamponada con fosfato	Himedia	TS1006
EDTA	VWR	97061-406	Se utiliza para diluir la tripsina para el cultivo de tejidos
FBS 100% de origen estadounidense	VWR	97068-085	Componente de los medios de crecimiento completos
L-Glutamina	Gibco	25030-081	Componente de los medios de crecimiento completos
Células de cáncer de mama de ratón, 4T1	Instituto Oncológico Karmanos	Aslakson, CJ et al.,1992	Línea celular de cáncer mamario metastásico en ratón
Penicilina Estreptomicina	Gibco	Números 15140-122	Componente de los medios de crecimiento completos