Ensayo de inmunofluorescencia CTC: una técnica para caracterizar las células tumorales circulantes

Resumen

Fuente: García, J., et al. Caracterización semiautomática de PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas mediante inmunofluorescencia.J. Vis. Exp.(2019)

Este video describe el ensayo de inmunofluorescencia de células tumorales circulantes (CTC), una técnica para caracterizar los biomarcadores en células tumorales circulantes en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Este ensayo podría usarse para monitorear los cambios dinámicos del tumor y la respuesta inmunitaria, que pueden reflejar la respuesta a la quimioterapia, la radiación y los posibles tratamientos de inmunoterapia.

Protocolo

1. Tinción de inmunofluorescencia

1. Enumere en un portaobjetos con cámara con una cuadrícula tipo hemocitómetro el número de células por mL. Diluir la muestra enriquecida con una solución antiaglutinante al 0,2% (tabla de materiales) hasta una concentración que alcance las 100.000 células/100 μL por citospin.
2. Humedecer el contorno de la cámara de muestras con algodón (Tabla de Materiales) con 50 μL de solución antiaglutinante al 0,2%. Coloque un portaobjetos de vidrio de polilisina en la cámara de muestras y ciérrelo.
3. Cubra una punta con una solución antiaglutinante al 0,2 % pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Vuelva a suspender la muestra enriquecida y transfiera la solución celular a la cámara de muestras. Centrífuga con una centrífuga dedicada (Tabla de Materiales) a 400 rpm durante 4 min (aceleración baja).
4. Coloque un aislador de silicona alrededor del área de deposición. Deje secar el portaobjetos de vidrio debajo de una cabina de seguridad microbiológica durante 2 minutos.
5. Prepare la solución de fijación diluyendo 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 16% con 3 mL de PBS estéril. Añadir 100 μL de solución de fijación (4% PFA) por muestra e incubar en RT durante 10 min. Retire la solución de fijación y realice tres lavados con 200 μL de PBS e incube a RT cada uno durante 2 min.
   PRECAUCIÓN: Use PFA debajo de un gabinete de seguridad química para evitar la inhalación.
6. Prepare la solución de saturación diluyendo el suero fetal bovino (FBS) al 5%, el reactivo bloqueante del receptor Fc (FcR) al 5% y la albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS estéril (Tabla de materiales). Añadir 100 μL de solución de saturación por muestra e incubar durante 30 min a RT. Retirar la solución de saturación.
7. Añadir 100 μL de solución de anticuerpos por muestra (anticuerpo CD45 1/20; anticuerpo PanCK 1/500; anticuerpo PD-L1 1/200; Solución de saturación Qsp 100 μL) (Tabla de Materiales). Coloque el portaobjetos de vidrio de polilisina en una placa de Petri de 100 mm x 15 mm. Humedecer un papel absorbente con 2 mL de agua estéril y cerrar la placa de Petri con la tapa. Colocar a 4 °C durante la noche y proteger de la luz.
8. Retirar la mezcla de anticuerpos y realizar 3 lavados con 200 μL de PBS incubando cada lavado durante 2 min. Deje secar la muestra durante 5 minutos y protéjala de la luz. Coloque 10 μL de solución de montaje (Tabla de Materiales) en el área de deposición y cubra con un cubreobjetos de microscopio sin hacer una burbuja. Sella el cubreobjetos con esmalte de uñas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Solución anti-aglutinante. Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Citoembudos EZ	ThermoFisher	A78710003	Cámara de muestras con algodón. Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Centrífuga Shandon Cytopsin4	ThermoFisher	A78300003	Centrífuga dedicada. Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Paraformaldehído 16%	ThermoFisher	11490570	Solución de fijación. Condiciones de almacenamiento: +4°C
Solución salina tamponada con fosfato Ultra Pura Grado 1X – 1L	1º Laboratorio Base	BUF-2040-1X1L	Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Agente de bloqueo FcR	Miltenyi Biotec	130-059-901	Condiciones de almacenamiento: +4°C
Anticuerpo monoclonal PD-L1 (clon 29E2A3) - Ficoeritrina	BioLeyenda	BLE329706	Condiciones de almacenamiento: +4°C
Anticuerpo monoclonal PanCK (clon AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Condiciones de almacenamiento: +4°C
Anticuerpo monoclonal CD45 (clon HI30) Alexa Fluor 647	BioLeyenda	BLE304020	Condiciones de almacenamiento: +4°C
Montaje fluorado	sigma	F4680	Solución de montaje. Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
placa de Petri	Dutscher	632180	Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Condiciones de almacenamiento: +4°C
Portaobjetos de polilisina	ThermoFisher	J2800AMNZ	Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Aislador de silicio	Grace bio-Labs	664270	Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Agua desionizada estéril – 100 mL	1º Laboratorio Base	CUS-4100-100ml	Condiciones de almacenamiento: Temperatura ambiente
Suero de ternera fetal (FCS)	Gibco	10270-106	Condiciones de almacenamiento: +4°C