Inflado de agarosa en todo el pulmón: un método de preparación de los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo

Resumen

Fuente: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Imágenes en vivo ex vivo de metástasis pulmonares y su microentorno, J. Vis. Exp. (2016)

Este video describe un método de preparación de pulmones para imágenes en vivo ex vivo para estudiar las interacciones entre las células cancerosas y las células estromales, utilizando agarosa para el inflado. En el protocolo de muestra, se describe el procedimiento de inflado de agarosa antes de observar las interacciones celulares vivas.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo

NOTA: Trate de trabajar lo más estéril y cuidadoso posible para evitar desafíos innecesarios de las células inmunitarias dentro de los pulmones.

1. Inyectar al ratón por vía intraperitoneal (i.p.) una sobredosis letal de un anestésico permitido por el protocolo animal aprobado por la IACUC, por ejemplo

Resultados

Figura 1. Protocolo de preparación de pulmones para la obtención de imágenes en vivo.(A) Exposición de la tráquea después de la preparación del ratón. (B) Pequeño corte hecho en la tráquea expuesta paralela a los anillos cartilaginosos. (C) Aguja de 20 G insertada 4-5 mm en la tráquea. (D) Instilación de 400 μ.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anestésico	Na	Na	Anestesia aprobada por IACUC, utilizada para anestesia y/o eutanasia
PBS, USP estéril	Amresco INC	K813-500ML	Grado ultra puro para inyección intravenosa
1X PBS	Instalación de cultivo celular de la UCSF	Na
Plataforma de espuma de poliestireno	Na	Na	Se utilizará como tablero de disección
Tijeras finas afiladas	Herramientas de Bellas Ciencias	14060-11
Aguja de 20 G x 1, bisel corto	Bd	305178
fórceps	Tienda quirúrgica Roboz	RS-5135
Jeringa de 1 ml sin aguja	Bd	309659
Agarosa a baja temperatura de fusión	Lonza	50111	Para hacer 10 ml de solución, pese 0,2 g de agarosa, agregue a 10 ml 1 x PBS y caliente para disolver. La agarosa se solidificará a temperatura ambiente, así que manténgala en un baño de agua a 37 °C hasta que se use para inflar.
RPMI-1640 medio sin rojo fenol	Tecnologías de la Vida	11835-030
Placa de imagen de 24 pocillos	E&K científico	EK-42892
Correderas con cubierta de vidrio, 15 mm	Fisher Científico	22-031-144
Controlador digital de CO2 y temperatura	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Cámara climática	Okolab	Na	http://www.oko-lab.com
Microscopio confocal de disco giratorio Cell Observer	Zeiss	Na
aire	Ucsf	Na
oxígeno	Ucsf	Na
dióxido de carbono	Ucsf	Na