Inflado de agarosa en todo el pulmón: un método de preparación de los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo

En este artículo

Resumen

Fuente: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Imágenes en vivo ex vivo de metástasis pulmonares y su microentorno, J. Vis. Exp. (2016)

Este video describe un método de preparación de pulmones para imágenes en vivo ex vivo para estudiar las interacciones entre las células cancerosas y las células estromales, utilizando agarosa para el inflado. En el protocolo de muestra, se describe el procedimiento de inflado de agarosa antes de observar las interacciones celulares vivas.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo

NOTA: Trate de trabajar lo más estéril y cuidadoso posible para evitar desafíos innecesarios de las células inmunitarias dentro de los pulmones.

Inyectar al ratón por vía intraperitoneal (i.p.) una sobredosis letal de un anestésico permitido por el protocolo animal aprobado por la IACUC, por ejemplo, 1 ml de Avertin al 2,5%. Espere a que el ratón deje de respirar y no responda en absoluto a los estímulos nocivos (pellizco de la pata trasera).
NOTA: La luxación cervical y la eutanasia con dióxido de carbono deben evitarse, ya que pueden afectar negativamente la viabilidad de las células pulmonares.
Inmovilizar al ratón en una tabla de disección y esterilizar al ratón con etanol al 70%.
Use tijeras quirúrgicas para hacer primero una incisión epigástrica transversal a través de la piel, seguida de una incisión similar a través del peritoneo. Sostenga la tabla de disección en posición vertical y corte la aorta descendente, de modo que la sangre se acumule en el abdomen y no en la cavidad torácica.
Corta una pequeña abertura en el diafragma para liberar el vacío. Corte a lo largo de la 10ª y 12ª costilla para extirpar el diafragma y obtener acceso visual a los pulmones.
Use tijeras quirúrgicas para cortar la piel hasta la tráquea sobre la caja torácica, pero deje la caja torácica intacta. Separa la piel de la caja torácica. Exponga la tráquea eliminando el tejido conectivo circundante, teniendo cuidado de no dañar la tráquea misma (Figura 1A).
Cortar una pequeña abertura de aproximadamente 1 mm de diámetro en la tráquea expuesta paralela a los anillos cartilaginosos, lo más cerca posible de la laringe (Figura 1B). Tenga cuidado de no cortar completamente la tráquea.
Tome una aguja de 20 G e inserte suavemente la aguja 4-5 mm en la tráquea sin ninguna fuerza contraria (Figura 1D). El extremo de la aguja debe ser visible a través de la tráquea (Figura 1C). Use pinzas para estabilizar la aguja en la tráquea. Alternativamente, se puede atar una sutura alrededor de la tráquea para mantener la aguja en su lugar.
NOTA: Al insertar demasiado profundamente, la carina puede traumatizarse o solo un lado de los pulmones puede estar inflado.
Llene una jeringa con 400 μl de agarosa a baja temperatura de fusión al 2% (tomada directamente de un baño a temperatura constante) a 37 °C. Asegúrese de que la tabla de disección esté en pie y lentamente instilar la agarosa tibia a través de la aguja en los pulmones, use ~ 400 μl para inflar los pulmones.
NOTA: Observe cómo se inflan los pulmones dentro de la caja torácica. No infle demasiado el pulmón, ya que se romperá.
Una vez que los pulmones estén inflados, llenando ~ 2/3 de la caja torácica, separe la jeringa y mantenga la aguja dentro de la tráquea para evitar que la agarosa se escape.
Vierta aproximadamente 50 ml de PBS a 20 °C sobre los pulmones inflados para permitir que la agarosa dentro de los pulmones se asiente y solidifique. Retire lentamente la aguja y cierre la tráquea con pinzas para evitar que se filtre agarosa no solidificada.
Exponer los pulmones mediante la realización de una esternotomía y, posteriormente, extirpar los pulmones. Para la extirpación de los pulmones, sujétese la tráquea mientras corta la tráquea por completo. Tire suavemente de la tráquea hacia arriba, corte el tejido conectivo y el esófago mientras extrae los pulmones de la cavidad torácica hasta que los pulmones se separen del ratón (Figura 1E).
Sumerja los pulmones en RPMI-1640 tibio para lavar el exceso de sangre y separe suavemente los lóbulos usando tijeras y pinzas para cortar el bronquio del tallo principal de los lóbulos en el hilio (Figura 1F).
Coloque los lóbulos, con la superficie plana hacia abajo para maximizar la superficie de imagen, en un pocillo de una placa de imágenes de 24 pocillos (Figura 1G). Añadir 100 μl de RPMI-1640 a 37 °C en la parte superior de los lóbulos. Coloque varios portaobjetos circulares de 15 mm en la parte superior de los lóbulos para evitar que flote.
Vierta PBS tibio en los pozos circundantes para evitar que el medio RPMI-1640 se evapore. Inserte la placa de 24 pocillos en la cámara climática equilibrada y mantenga los lóbulos pulmonares a 37 °C con aire y 5% de CO₂. Inserte la cámara climática en la platina del microscopio confocal.
NOTA: También se podrían considerar otras mezclas de gases (por ejemplo, 5% de_O2, 5% de CO₂ en N₂ para examinar el comportamiento de la célula en condiciones de hipoxia/menor oxígeno).

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Resultados

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Figura 1. Protocolo de preparación de pulmones para la obtención de imágenes en vivo.(A) Exposición de la tráquea después de la preparación del ratón. (B) Pequeño corte hecho en la tráquea expuesta paralela a los anillos cartilaginosos. (C) Aguja de 20 G insertada 4-5 mm en la tráquea. (D) Instilación de 400 μ...