1. Pasaje y cultivo de células TUM622 en cultivos 2D
- Medio de cultivo 3D caliente y reactivos de disociación celular (ver Tabla de Materiales) para células TUM622 a 37 °C.
- Paso de células TUM622 al 80% de confluencia en matraces 2D. Por lo general, esto ocurre 1 semana después de fallecer.
- Deseche el medio viejo de un matraz T75 y lávelo una vez con 6 mL de tampón HEPES. Evite pipetear directamente sobre las células.
- Aspire el tampón HEPES. Agregue 4 mL de tripsina/EDTA (0.25 mg/mL, ver Tabla de Materiales) para un enjuague rápido y deseche la tripsina/EDTA.
- Añadir 2 mL de tripsina/EDTA e incubar a 37 °C durante 5 min. Retire los matraces de la incubadora y golpee los matraces para aflojar las celdas sin crear burbujas de aire y devuelva los matraces a la incubadora durante 5 min.
nota: La exposición prolongada a la tripsina dañará irreversiblemente las células y alterará su fenotipo, por lo que se recomienda limitar el tiempo que las células están expuestas a la tripsina.
- Confirme que las células se han desprendido y disociado bajo un microscopio óptico (4x o 10x). Agregue 4 mL de tampón de neutralización (tampón TNS) (consulte la información del reactivo de subcultivo en la Tabla de materiales) seguido de 10 mL de medio de cultivo 3D (consulte la Tabla de materiales).
- Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo para disociar aún más las células con una pipeta de 10 ml. Transfiera la suspensión a través de un filtro de células de 40 μm a un tubo cónico de 50 mL.
- Cuente el número de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
- Semilla 0,8 x 10 matraz de6 células/T75 en 20 mL de medio de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales).
- Alimente las células cada dos días reemplazando la mitad del medio gastado con medio nuevo.
2. Siembra de células TUM622 en la matriz extracelular para el cultivo en 3D
- El día antes del experimento, descongele los viales de la matriz de membrana basal en un refrigerador a 4 °C durante la noche. Enfriamiento de pipetas de plástico (2 mL) y puntas a -20 °C durante la noche.
nota: No todos los lotes de matriz de membrana basal tienen la misma capacidad para soportar el crecimiento 3D de las células TUM622. Por lo tanto, es necesario adquirir y probar múltiples lotes de matriz de membrana basal para identificar aquellos que apoyan la formación robusta de acinos. Por lo general, esto requiere una mayor concentración de proteínas (16-18 mg/mL) en la matriz.
- El día del experimento, se calentó el medio de cultivo 3D, el tampón HEPES, la tripsina/EDTA y el tampón de neutralización de tripsina (TNS) en un baño de agua a 37 °C. Inmediatamente antes de configurar el cultivo, saque la matriz de membrana basal descongelada del refrigerador y coloque el vial en hielo.
- Enfríe las placas de cultivo de tejidos en un enfriador de plataforma metálica colocado sobre hielo. Coloque los tubos de centrífuga en una rejilla de enfriamiento de metal sobre hielo.
- Utilizando las células TUM622 obtenidas en el paso 1.7, calcule el número deseado de células necesarias para la siembra. Por lo general, se necesitan entre 15.000 y 30.0000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos. Una densidad más baja es más adecuada para la obtención de imágenes y la cuantificación, mientras que la densidad más alta es preferible cuando se recolectan células para la extracción de ARN o la transferencia occidental.
- Transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga enfriado (cada tubo contiene células para el triplicado) y centrifuga a 300 x g en una centrífuga de cubo colgante a 4 °C durante 5 min.
- Aspire el sobrenadante con cuidado con una pipeta de aspiración conectada a una punta sin filtrar (20 μL), dejando aproximadamente 100 μL del medio en el tubo (utilice las marcas del tubo como guía).
- Golpee suavemente el costado del tubo para desalojar y disociar el pellet antes de devolverlo a la rejilla de enfriamiento.
- Con las pipetas preenfriadas de 2 ml, mezcle suavemente la matriz pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces mientras mantiene el vial en contacto con el hielo. Pipetear a una velocidad uniforme y moderada para que no se introduzcan burbujas en la matriz durante este procedimiento.
- Transfiera el volumen apropiado de la matriz a cada tubo de centrífuga. Para enchapar triplicados en una placa de 24 pocillos, agregue 1,1 mL de matriz de membrana basal a cada tubo.
- Con puntas preenfriadas, pipetee la matriz en cada tubo hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces para hacer una suspensión celular uniforme.
- Transfiera 310 μL de suspensión de celda/matriz a cada pocillo de una placa preenfriada de 24 pocillos. La pipeta se coloca en un ángulo de 90° con respecto a la superficie de la placa y la suspensión se añade al centro del pocillo. La suspensión debe extenderse y cubrir todo el pozo sin necesidad de inclinar la placa.
- Para facilitar el análisis de inmunofluorescencia posterior, coloque la suspensión de la célula/matriz en paralelo en portaobjetos de cámara de 2 pocillos. Transfiera 100 μL de suspensión de celda/matriz al centro de un pocillo de portaobjetos de cámara de 2 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Esto permite que la matriz forme una estructura en forma de cúpula con un volumen mucho menor.
- Regrese la placa y la cámara, deslícela nuevamente a una incubadora de cultivo de tejidos e incube durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique. Examine la placa/portaobjetos bajo un microscopio óptico para asegurarse de que las células individuales se distribuyan uniformemente dentro de la matriz (4x o 10x).
- Agregue 1 mL de medio completo de cultivo 3D precalentado en cada pocillo y 1,5 mL de medio de cultivo 3D a cada pocillo del portaobjetos de la cámara, luego devuélvalos a la incubadora.
