Ensayo de extracción de ARN: un método para extraer ARN de células de cáncer de pulmón transfectadas con miARN

Resumen

Fuente: Hossian, A. K. M. N. et al., Análisis de tratamientos combinatorios de miRNA para regular el ciclo celular y la angiogénesis. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe el protocolo de extracción de ARN de células de cáncer de pulmón transfectadas con miARN. Este enfoque se puede utilizar para identificar una actividad de tratamiento combinatoria de miRNA para detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Protocolo

1. Transfección de miR-143 y miR-506

>PRECAUCIÓN: Utilice guantes de látex, gafas protectoras y una bata de laboratorio mientras realiza los experimentos descritos. Cuando sea necesario, utilice la cabina de bioseguridad con el ventilador del armario encendido, sin bloquear las vías respiratorias ni perturbar el flujo de aire laminar. Coloque siempre la ventana de vidrio protectora a la altura adecuada, según lo descrito por el fabricante.

1. Siembre células NSCLC A549 en un matraz T25 cm2/placa de pocillos 6/96 pocillos en medio DMEM/F12K suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (medios de cultivo) en una campana de cultivo de tejidos e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂ en una incubadora de cultivo de tejidos.
2. Suspender miR-143 y/o miR-506 imitadores, o mezclar siRNA con agente transfecético (se mezclaron 2,4 μg de miR con 14 μL de agente transfeccional; ver Tabla de materiales) en 500 μL de medio de transfección y 1,5 mL de suero y medios DMEM/F12K libres de antibióticos a una concentración final de miRNA de 100 nM. La cantidad de miRNA puede requerir optimización en diferentes células y concentraciones. Los enfoques apropiados incluyen la transfección de células con concentraciones crecientes de miARN (es decir, 50-200 nM) y la evaluación de la regulación a la baja de la expresión de los genes de interés.
3. Retire los medios de cultivo del matraz/placa y lávelos una vez con 1x PBS.
4. Añadir complejos de miRNA/agente transfector e incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 6 h (el tamaño del matraz define el volumen de incubación añadido).
5. Sustituya el medio por 4 ml de medio de cultivo e incube las células durante 24 h y/o 48 h.
6. Recolectar las células transfectadas por tripsinización, añadiendo 1 mL de tripsina-EDTA en cada matraz T25^cm2, incubar durante 5-10 min a 37 °C y añadir 3 mL de medio de cultivo para recolectar las células. Coloque el contenido de cada matraz en un tubo de 15 ml separado y marcado. Trabajar en una campana de cultivo de tejidos.
7. Centrifugar a 751 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
   nota: Se requiere precaución durante la extracción del sobrenadante, ya que la agitación del tubo puede causar la pérdida de células.
8. Añadir 2 mL de 1x PBS y centrifugar durante 5 min a 751 x g.
9. Repita los pasos 7 y 8 una vez para eliminar cualquier rastro de medio y sobrenadante.
   nota: En esta etapa, los tubos de muestra se pueden almacenar a -80 °C o se pueden usar inmediatamente.

>2. Extracción de ARN

1. Limpie el área de trabajo rociando con alcohol isopropílico al 70% y solución de descontaminación de ARNasa.
La
2. extracción de ARN debe realizarse utilizando un kit de ARN adecuado (ver Tabla de Materiales).
3. Retire los tubos a -80 °C y deje que se descongelen. Añadir 300 μL de tampón de lisis y pipetear hacia arriba y hacia abajo para romper la membrana celular.
4. Agregue un volumen igual de etanol 100% ultrapuro.
5. Mezcle bien y colóquelo en una columna de separación.
6. Centrifugar entre 11 y 16 x g durante 30 s y eliminar el flujo.
7. Añadir 400 μL de tampón de lavado y centrifugar para eliminar el tampón.
8. Añadir 5 μL de ADNasa I con 75 μL de tampón de digestión de ADN en cada muestra e incubar durante 15 min.
9. Lave la muestra con 400 μL de tampón de preparación de ARN.
10. Lavar 2 veces con tampón de lavado de ARN.
11. Agregue agua sin nucleasas a la columna, centrifugue y luego recoja el ARN.
12. Mida la concentración total de ARN con un espectrofotómetro UV.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A549 Células de cáncer de pulmón de células no pequeñas	ATCC	ATCC CCL-185
Silenciador Ambion Control Negativo Nº 1 siRNA	Ambiente	AM4611
has-miR-143-3p miRNA Mímico	Abm	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mímico	Abm	MCH02824
Suero fetal bovino (FBS)	Fisher Científico	10438026
Solución salina tamponada con fosfato HyClone (PBS)	Fisher Científico	SH30256FS
DMEM 4,5 g/L de glucosa, sin piruvato de sodio, con L-glutamina	VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNasa/Agua destilada sin RNasa	Invitrogen	Teléfono 10-977-015
Kits de ARN rápido	Investigación de Zymo	R1055
Etanol, Absoluto (200 Proof), Grado de Biología Molecular,	Biorreactivos de Fisher	BP2818500
-80 °C Congelador	VWR	VWR40086A
Nanogota	Termo Científico	NanoDrop una C
Placa de 96 pocillos	CELLTREAT Científico	50-607-511
Penicilina-estreptomicina 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
Incubadora de CO2	Termo Científico	HERAcell 150i
ADN	Investigación de Zymo	E1010
Mezcla de nutrientes F-12K (Kaighn's Mod.) con L-glutamina, Corning	Corning	45000-354
Suero Fetal Bovino - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Centrífuga de temperatura controlada matchine	Termo Científico	ST16R
Matchine de microcentrífuga con control de temperatura	Eppendrof	5415R