1. Transfección de miR-143 y miR-506
>PRECAUCIÓN: Utilice guantes de látex, gafas protectoras y una bata de laboratorio mientras realiza los experimentos descritos. Cuando sea necesario, utilice la cabina de bioseguridad con el ventilador del armario encendido, sin bloquear las vías respiratorias ni perturbar el flujo de aire laminar. Coloque siempre la ventana de vidrio protectora a la altura adecuada, según lo descrito por el fabricante.
- Siembre células NSCLC A549 en un matraz T25 cm2/placa de pocillos 6/96 pocillos en medio DMEM/F12K suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (medios de cultivo) en una campana de cultivo de tejidos e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos.
- Suspender miR-143 y/o miR-506 imitadores, o mezclar siRNA con agente transfecético (se mezclaron 2,4 μg de miR con 14 μL de agente transfeccional; ver Tabla de materiales) en 500 μL de medio de transfección y 1,5 mL de suero y medios DMEM/F12K libres de antibióticos a una concentración final de miRNA de 100 nM. La cantidad de miRNA puede requerir optimización en diferentes células y concentraciones. Los enfoques apropiados incluyen la transfección de células con concentraciones crecientes de miARN (es decir, 50-200 nM) y la evaluación de la regulación a la baja de la expresión de los genes de interés.
- Retire los medios de cultivo del matraz/placa y lávelos una vez con 1x PBS.
- Añadir complejos de miRNA/agente transfector e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 6 h (el tamaño del matraz define el volumen de incubación añadido).
- Sustituya el medio por 4 ml de medio de cultivo e incube las células durante 24 h y/o 48 h.
- Recolectar las células transfectadas por tripsinización, añadiendo 1 mL de tripsina-EDTA en cada matraz T25cm2, incubar durante 5-10 min a 37 °C y añadir 3 mL de medio de cultivo para recolectar las células. Coloque el contenido de cada matraz en un tubo de 15 ml separado y marcado. Trabajar en una campana de cultivo de tejidos.
- Centrifugar a 751 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
nota: Se requiere precaución durante la extracción del sobrenadante, ya que la agitación del tubo puede causar la pérdida de células.
- Añadir 2 mL de 1x PBS y centrifugar durante 5 min a 751 x g.
- Repita los pasos 7 y 8 una vez para eliminar cualquier rastro de medio y sobrenadante.
NOTA: En esta etapa, los tubos de muestra se pueden almacenar a -80 °C o se pueden usar inmediatamente.
2. Análisis del ciclo celular
- Siembre 5 x 105 celdas para cada muestra en un matraz T25cm2 y realice una transfección de acuerdo con el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
- A las 24 h y 48 h, se recogen las células por tripsinización.
- Transfiera las suspensiones celulares a tubos estériles de 15 ml y etiquételos correctamente.
- Centrifugar las muestras a 751 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Agregue 2 mL de 1x PBS helado, vórtice y centrifuga a 751 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Repita el paso de lavado con 1x PBS para eliminar los medios residuales.
- Vuelva a suspender y rompa el pellet añadiendo 200 μL de PBS 1x helado por pipeteo.
- Fije las celdas agregando 2 mL de etanol helado al 70% gota a gota al tubo mientras se agita suavemente.
- Incubar los tubos durante 30 min a RT y colocar los tubos a 4 °C durante 1 h.
- Retire los tubos a 4 °C y centrifugue a 751 x g durante 5 min.
- Agregue 2 mL de 1x PBS helado, vórtice y centrifuga a 751 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Añadir 500 μL de PBS 1x con yoduro de propidio (50 μg/mL) y ribonucleasa A (200 μg/mL).
- Incubar durante 30 min en RT mientras se protegen las muestras de la luz.
- Adquisición de datos en el citómetro de flujo. Utilice la dispersión frontal frente a la dispersión lateral (FSC frente a SSC) para seleccionar la población principal de células, excluyendo los residuos en la esquina inferior izquierda de la gráfica de densidad FSC frente a SSC y los grupos de células en la parte superior superior derecha de la gráfica de densidad FSC frente a SSC.
- Analice los datos para la identificación de poblaciones celulares por etapa del ciclo celular con el software adecuado.