$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Transfección de miR-143 y miR-506
>PRECAUCIÓN: Utilice guantes de látex, gafas protectoras y una bata de laboratorio mientras realiza los experimentos descritos. Cuando sea necesario, utilice la cabina de bioseguridad con el ventilador del armario encendido, sin bloquear las vías respiratorias ni perturbar el flujo de aire laminar. Coloque siempre la ventana de vidrio protectora a la altura adecuada, según lo descrito por el fabricante.
- Siembre células NSCLC A549 en un matraz T25 cm2/placa de pocillos 6/96 pocillos en medio DMEM/F12K suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (medios de cultivo) en una campana de cultivo de tejidos e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos.
- Suspender miR-143 y/o miR-506 imitadores, o mezclar siRNA con agente transfecético (se mezclaron 2,4 μg de miR con 14 μL de agente transfeccional; ver Tabla de materiales) en 500 μL de medio de transfección y 1,5 mL de suero y medios DMEM/F12K libres de antibióticos a una concentración final de miRNA de 100 nM. La cantidad de miRNA puede requerir optimización en diferentes células y concentraciones. Los enfoques apropiados incluyen la transfección de células con concentraciones crecientes de miARN (es decir, 50-200 nM) y la evaluación de la regulación a la baja de la expresión de los genes de interés.
- Retire los medios de cultivo del matraz/placa y lávelos una vez con 1x PBS.
- Añadir complejos de miRNA/agente transfector e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 6 h (el tamaño del matraz define el volumen de incubación añadido).
- Sustituya el medio por 4 ml de medio de cultivo e incube las células durante 24 h y/o 48 h.
2. Expresión de proteínas por microarray del ciclo celular de anticuerpos
- Siembre 5 x 105 celdas para cada muestra enmatraces T25 cm 2 y realice una transfección de acuerdo con el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
- Pasadas las 24 h y 48 h, recolectar células por tripsinización.
- Transfiera las suspensiones celulares a tubos de 15 ml y etiquételos en consecuencia.
- Centrifugar a 751 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Agregue 2 mL de 1x PBS helado, vórtice y centrifugar a 751 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Repita el paso de lavado con 1x PBS.
- Añadir 150 μL de tampón de lisis complementado con inhibidores de la proteasa. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para alterar las membranas celulares.
- Para evitar cualquier interferencia con el tampón de lisis, realice un intercambio de tampones para reemplazar el tampón de lisis con tampón de etiquetado, utilizando las columnas de intercambio de solventes del fabricante.
- Cuantificar la proteína total con un ensayo de BCA.
- Tome 70 μg de muestra de proteína y agregue tampón de etiquetado para lograr un volumen final de 75 μL.
- Añadir 100 μL de dimetilformamida (DMF) a 1 mg de reactivo de biotina (biotina/DMF).
- Añadir 3 μL de biotina/DMF a cada muestra de proteína (muestra de proteína biotinilada) e incubar durante 2 h a RT.
- Añadir 35 μL de reactivo stop y mezclar por vórtice.
- Incubar las muestras en RT durante 30 min.
- Retire los portaobjetos de microarray del refrigerador para que se calienten a RT durante 1 h antes de usar.
- Realice el bloqueo para la unión inespecífica incubando los portaobjetos con una solución de leche en polvo al 3% (en el reactivo de bloqueo proporcionado por el fabricante) en una placa de Petri con agitación continua durante 45 min a RT.
- Lave los portaobjetos con agua ddH2O (a menos que se especifique lo contrario, el lavado se realiza con ddH2O).
- Repita el paso de lavado ~ 10 veces para eliminar completamente la solución de bloqueo de las superficies deslizantes. Esto es importante para lograr un fondo uniforme y bajo.
- Retire el exceso de agua de las superficies de los portaobjetos y continúe con el siguiente paso sin dejar que los portaobjetos se sequen.
- Prepare la solución de acoplamiento disolviendo leche en polvo al 3% en un reactivo de acoplamiento.
- Añadir 6 mL de la solución de acoplamiento y a la cantidad total de la muestra de proteína biotinilada previamente preparada del paso 12.
- Coloque un portaobjetos en un pocillo de la cámara de acoplamiento proporcionada por el proveedor y agregue ~ 6 mL de mezcla de acoplamiento de proteínas.
nota: Asegúrese de que el portaobjetos esté completamente sumergido en la solución de mezcla de acoplamiento de proteínas.
- Cubrir la cámara de acoplamiento e incubar durante 2 h a RT con agitación continua en un agitador orbital.
- Transfiera los portaobjetos a una placa de Petri y agregue 30 mL de tampón de lavado 1x. Coloque la placa de Petri en un agitador orbital, agite durante 10 minutos y deseche la solución.
- Repita el paso 24 2x.
- Enjuague los portaobjetos con abundante agua ddH2O como se describe en los pasos 17 y 18 y proceda al siguiente paso inmediatamente para evitar que se sequen.
- Añadir 30 μL de Cy3-estreptavidina (0,5 mg/mL) en 30 mL de tampón de detección.
- Coloque el portaobjetos en una placa de Petri y agregue 30 mL de tampón de detección que contenga Cy3-estreptavidina.
- Incubar en un agitador orbital durante 20 min con agitación continua protegido de la luz.
nota: Cy-3 es un tinte fluorescente. Cubra con papel de aluminio u opere en condiciones de oscuridad para mantener la intensidad de la fluorescencia.
- Realice los pasos 24-26 y deje que el portaobjetos se seque con un chorro de aire suave o colocando el portaobjetos en un tubo cónico de 50 ml y centrifugue a 1300 x g durante 5-10 minutos.
- Coloque la corredera en el soporte de la corredera y cúbrala con papel de aluminio.
- Escanee el portaobjetos en un escáner de microarrays con las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas. En el caso de Cy3, el pico de longitud de onda de excitación es de ~550 nm y el pico de emisión de ~570 nm.
- Analice los datos (consulte la Tabla de materiales para conocer el software utilizado).