Preparación del pulmón de ratón para la citometría de flujo: generación de suspensión celular a partir de tejido pulmonar para el análisis de citometría de flujo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación pulmonar para la citometría de flujo

1. En el criterio de valoración experimental deseado, sedar al ratón mediante una inyección subcutánea de una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y eutanasiarlo mediante luxación cervical.
2. Remoje la carcasa en etanol al 70% y asegure el ratón en una tabla de disección con cinta adhesiva.
3. Haga una incisión en la línea media ventral e invierta suavemente la piel para exponer los músculos de la pared torácica y los órganos abdominales. Perfora el diafragma y corta las costillas con unas tijeras para exponer la cavidad torácica.
4. Perfundir los pulmones 3 veces con 6 a 8 mL de PBS helado a través del ventrículo derecho usando una aguja de 27 G después de cortar una pequeña abertura en el ventrículo izquierdo para permitir que la sangre salga. Los pulmones deben limpiarse de sangre y volverse completamente blancos.
5. Saca los pulmones y pica los lóbulos en trozos pequeños con unas tijeras. Transfiera las piezas pulmonares a un tubo de microcentrífuga de 2 mL e incube en 1,5 mL de tampón de digestión pulmonar (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL de colagenasa I y 50 U/mL de DNasa I).
6. Incubar las piezas pulmonares 30 - 60 min a 37 °C y con agitación constante.
7. Transfiera la suspensión de células pulmonares a través de un filtro de células de 70 μm a un tubo de 50 ml. Limpie el colador con la parte posterior de una jeringa estéril de 10 ml y enjuague el colador con 15 ml de PBS con FCS al 2 %.
8. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio (ACK) e incube durante 5 min a temperatura ambiente para la lisis de los eritrocitos residuales.
9. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C y resuspender las células en 1 mL de PBS con FCS al 2% y proceder con el protocolo de tinción deseado para la citometría de flujo
   nota: Alternativamente, las células pueden resuspenderse en RPMI que contenga un 30% de FCS y un 10% de DMSO y congelarse utilizando un contenedor de congelación para su posterior análisis.