Preparación del pulmón de ratón para la citometría de flujo: generación de suspensión celular a partir de tejido pulmonar para el análisis de citometría de flujo

Resumen

Fuente: Moll, H. P., et al. Trasplante ortotópico de células singénicas de adenocarcinoma de pulmón para estudiar la expresión de PD-L1. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la preparación de la suspensión de células pulmonares de ratón para el análisis de citometría de flujo para estudiar la expresión de PD-L1 de las células de adenocarcinoma de pulmón.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación pulmonar para la citometría de flujo

1. En el criterio de valoración experimental deseado, sedar al ratón mediante una inyección subcutánea de una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y eutanasiarlo mediante luxación cervical.
2. Remoje la carcasa en etanol al 70% y asegure el ratón en una tabla de disección con cinta adhesiva.
3. Haga una incisión en la línea media ventral e invierta suavemente la piel para exponer los músculos de la pared torácica y los órganos abdominales. Perfora el diafragma y corta las costillas con unas tijeras para exponer la cavidad torácica.
4. Perfundir los pulmones 3 veces con 6 a 8 mL de PBS helado a través del ventrículo derecho usando una aguja de 27 G después de cortar una pequeña abertura en el ventrículo izquierdo para permitir que la sangre salga. Los pulmones deben limpiarse de sangre y volverse completamente blancos.
5. Saca los pulmones y pica los lóbulos en trozos pequeños con unas tijeras. Transfiera las piezas pulmonares a un tubo de microcentrífuga de 2 mL e incube en 1,5 mL de tampón de digestión pulmonar (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL de colagenasa I y 50 U/mL de DNasa I).
6. Incubar las piezas pulmonares 30 - 60 min a 37 °C y con agitación constante.
7. Transfiera la suspensión de células pulmonares a través de un filtro de células de 70 μm a un tubo de 50 ml. Limpie el colador con la parte posterior de una jeringa estéril de 10 ml y enjuague el colador con 15 ml de PBS con FCS al 2 %.
8. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio (ACK) e incube durante 5 min a temperatura ambiente para la lisis de los eritrocitos residuales.
9. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 °C y resuspender las células en 1 mL de PBS con FCS al 2% y proceder con el protocolo de tinción deseado para la citometría de flujo
   nota: Alternativamente, las células pueden resuspenderse en RPMI que contenga un 30% de FCS y un 10% de DMSO y congelarse utilizando un contenedor de congelación para su posterior análisis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular de adenocarcinoma de pulmón en ratón			Aislado en casa
Ratones C57Bl/6			Se puede utilizar F1 de la cruz de los dos fondos (8-12 semanas)
Ratones 129S
RPMI 1640 Medio	Tecnologías de la Vida	11544446
Suero de becerro fetal	Tecnologías de la Vida	11573397
Solución de penicilina/estreptomicina	Tecnologías de la Vida	11548876
L-Glutamina	Tecnologías de la Vida	11539876
Ketasol (100 mg/mL de ketamina)	Ogris Pharma	8-00173
Xilasol (20 mg/mL de xilacina)	Ogris Pharma	8-00178
Pinzas romas	Roboz	RS8260
Tijeras de iris para estudiantes	Herramientas de Bellas Ciencias	91460-11
DNasa I (libre de RNasa)	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	M0303S
Colagenasa Tipo I	Tecnologías de la Vida	17100017
Búfer de lisado ACK	Lonza	10-548E