Ensayo de inmunofluorescencia: un método para identificar células tumorales capturadas en un cable médico

Resumen

Fuente: Gallerani, G. et.al., Caracterización de células tumorales utilizando un cable médico para capturar células tumorales circulantes: un enfoque 3D basado en inmunofluorescencia y ADN FISH. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe la técnica de tinción por inmunofluorescencia de células tumorales circulantes capturadas en un cable médico funcionalizado. El alambre funcionalizado permite el aislamiento de CTC in vivo, directamente del torrente sanguíneo del paciente.

Protocolo

1. Immuno-DNA FISH en alambre

1. Espiga de línea celular en cable (soporte 3D)
   nota: La configuración preliminar implica una selección precisa de las líneas celulares adherentes en función de la positividad de EpCAM. El alambre se funcionaliza con anticuerpos anti-EpCAM para que solo se tiñan las células EpCAM positivas.
   nota: No toque la parte funcionalizada del cable para evitar cualquier daño.
   nota: Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
   1. Vuelva a suspender todo el contenido de un matraz T75 (80% de confluencia) en un vial de 5 mL utilizando 4 mL de medio completo; para un solo pico, se recomiendan alrededor de 2.000.000 de células para maximizar la adhesión de las células al alambre.
   2. Retire el alambre de su empaque de vidrio.
   3. Sumerja la parte dorada funcionalizada del alambre en el vial, asegurándose de que el tapón de alambre se ajuste herméticamente al vial. Sellar con film de laboratorio.
      nota: Se recomienda el uso de un tubo de 5 mL para permitir una correcta coincidencia entre el tapón de alambre y el vial.
   4. Incubar durante 30 min en RT en un rotador de tubo (ángulo 0-120).
   5. Enjuague el alambre tres veces en 1× solución de PBS usando 3 viales limpios diferentes.
2. Fijación y permeabilización
   cautela: La acetona es una sustancia inflamable que puede irritar las vías respiratorias. Utilice únicamente plásticos o recipientes de vidrio resistentes a la acetona (no PVC ni PVDF).
   nota: Realice estos pasos bajo una campana de gases químicos.
   1. Seca el alambre al aire.
   2. Fije las celdas sumergiendo el alambre en una solución de acetona al 100% durante 10 min en RT. Use un tubo de 5 mL.
      nota: El tapón de alambre no debe entrar en contacto con el fijador.
   3. Seque el cable al aire durante 5 minutos a RT.
      nota: El protocolo se puede pausar aquí. El cable debe almacenarse a -20 °C. Al empacar el cable para el almacenamiento a largo plazo, coloque el tapón de cable junto a la punta funcionalizada e inserte con cuidado el cable en el tubo de vidrio de almacenamiento, teniendo cuidado de no dañar la punta funcionalizada. Cierre el vaso de almacenamiento y guárdelo (vertical u horizontalmente) a -20 °C.
3. Inmunofluorescencia Día 1
   nota: Esta etapa implica una incubación durante la noche (~ 16 h).
   1. Lave dos veces en una solución de PBS 1× con un tubo de 5 ml.
   2. Incubar el alambre en tampón de dilución de anticuerpos durante 30 min a RT utilizando un tubo de 5 mL.
   3. Prepare 150 μL de mezcla de anticuerpos con una dilución de anticuerpo primario monoclonal conjugado con fluorocromo en tampón de dilución de anticuerpos, como se especifica en la hoja de datos. Por ejemplo, se utilizó el anticuerpo EpCAM-FITC con una dilución 1:20.
   4. Utilice una punta p200 para realizar la incubación, de la siguiente manera: extraiga el alambre del tapón de alambre e inserte suavemente el alambre a través del orificio más grande de la punta. Inserte primero el extremo no funcionalizado y tire lentamente del alambre a través del orificio más pequeño hasta que la parte dorada esté justo más allá del orificio más grande.
   5. Deje caer suavemente 150 μL de la mezcla de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpo anti EpCAM_FITC 1:20 diluido) en la punta. Para evitar el riesgo de formación de burbujas, gire suavemente el cable hasta que la parte funcionalizada esté completamente sumergida.
   6. Sella el agujero de la punta. Envolver una película de laboratorio alrededor del agujero puede ayudar.
   7. Incubar verticalmente durante la noche (~ 16 h) en la oscuridad a 4 °C.
4. Inmunofluorescencia día 2
   1. Bloquee la incubación de anticuerpos lavando el alambre dos veces en 1× PBS.
   2. Vuelva a insertar el cable en su tope de cable.
      nota: Almacenar en 1X PBS a 4 °C en un vial de 5 ml hasta que se realice el ensayo FISH.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
etanol	Carlo Erba	# 414605
Preadolescente 20	BIO RAD	# 1706531
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Medicago	# 09-9400-100
acetona	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
DE CAUCHO DE CEMENTO	Royal Talens	# 95306500
EpCAM-FITC (clon: HEA-125)	Mitenyi	#130-080-301
RPMI 1640	Gibco	# 31870-025
XT ALK BA	Sondas de MetaSystems	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		Alambre funcionalizado
Microscopio fluorescente ZEISS Axioskop	Zeiss
Software Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 de 64 bits	Nikon
Cámara digital Nikon DS-QiMc de 12 bits	Nikon	DS-QiMc