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1. Recolección de muestras de plasma
- Recoja 10 mL de muestra de sangre total en tubos Vacutainer con K2EDTA recubierto con aerosol y almacene a temperatura ambiente.
nota: Para minimizar la hemólisis, separe el plasma dentro de las 2 h. No almacene la sangre entera a baja temperatura (es decir, 4 °C) para evitar el choque térmico y la lisis celular que conducen a una liberación inespecífica de miARN.
- En 1 h, separar el plasma en una primera etapa de centrifugación a 1.258 x g y 4 °C durante 10 min.
- Transfiera el sobrenadante plasmático a un tubo de 15 mL, evitando cuidadosamente el contacto con el anillo linfocítico.
- Centrifugar el plasma por segunda vez a 1.258 x g y 4 °C durante 10 min.
- Alícuota 1 mL de plasma en crioviales de 1,5 mL, evitando recoger la fracción plasmática en la base del tubo.
- Almacene todas las alícuotas a -80 °C, excepto una para la evaluación de la hemólisis. El análisis molecular debe realizarse en un plazo de 5 semanas.
2. Extracción de ARN total por plasma
- Prepare una solución de 1-tioglicerol/homogeneización (OMG) con 20 μl de 1-tioglicerol por ml de solución de homogeneización. Dado que el 1-tioglicerol es viscoso, pipetee cuidadosamente para una medición precisa. Enfríe la solución OMG en hielo o a 2-10 °C antes de usarla.
nota: La solución de trabajo es estable a 2-10 °C durante 1 mes.
- Suspenda la DNasa I liofilizada añadiendo 275 μL de agua sin nucleasas en el vial y mezcle suavemente (no haga vórtice). Como ayuda visual, añada 5 μL de colorante azul a la DNasa I reconstituida y dispense la solución en alícuotas de un solo uso en tubos sin nucleasa. Almacene la DNasa I reconstituida a una temperatura de -30 °C a -10 °C.
- A partir de 200 μL de plasma, agregue 200 μL de la solución OMG refrigerada.
- Vórtice 15-30 s para asegurar una homogeneización completa. Si se produce espuma, deje que la muestra se asiente sobre hielo.
- Añadir 200 μL de tampón de lisis y 25 μL de proteinasa K a la muestra homogeneizada y al vórtice durante 20 s.
- Incubar las muestras durante 15 min en una batidora precalentada a 37 °C.
- Cargue un cartucho para cada muestra en la bandeja de la cubierta del instrumento y coloque el tapón en la posición correcta.
- Transfiera el lisado a la posición adecuada en el cartucho del instrumento.
- Añada 5 μL de solución de DNasa I en la posición correcta del cartucho.
- Añadir 60 μL de agua libre de nucleasas a la base de cada tubo de elución.
- Seleccione el método "RSC miRNA Tissue" y comience la ejecución de purificación automatizada. Las muestras totales de ARN se pueden almacenar a -80 °C.