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1. Seccionamiento GMA.
- Prepare una solución de amoníaco al 0,05% con agua destilada. Coloque el bisturí de vidrio y la biopsia en el micrótomo. Alinee cuidadosamente el bloque de biopsia con la cuchilla ajustando el soporte de la cuchilla y el ángulo del bloque de biopsia para que la hoja quede plana contra la superficie del bloque.
- Corte secciones de 2 μm de grosor con el micrótomo a una velocidad de corte lenta y use pinzas para transferir y hacer flotar las secciones en el agua de amoníaco. Flote las secciones durante 45-90 segundos, permitiendo la recuperación y el despliegue suaves del antígeno de la sección.
- Recoja secciones con portaobjetos de microscopio. Revise la histología de la biopsia tiñéndola rápidamente con azul de toluidina.
- Seque los portaobjetos en una placa calefactora a 50 °C y aplique 500 μl de tinte azul de toluidina filtrado en una sección con una pipeta Pasteur de plástico. Calienta la sección en la placa caliente hasta que comience a surgir un anillo verde en el borde de la mancha y luego lávala con agua.
- Con un microscopio óptico, revise la histología de la biopsia. Las secciones utilizadas para la inmunohistoquímica deben contener buenas áreas de lámina propia y epitelio intactos, con la menor cantidad posible de glándulas y la menor cantidad posible de músculo liso.
- Corte las secciones que tengan buena histología y recójalas con portaobjetos de microscopio recubiertos de poli L-lisina (recubiertos de PLL) para la tinción inmunohistoquímica. Corte al menos dos secciones de cada biopsia para su análisis. Seque los toboganes durante al menos 1 hora. Después del secado, las secciones pueden envolverse en papel de aluminio y almacenarse a -20 °C durante un máximo de 2 semanas, o se pueden inmunoteñir inmediatamente.
2. Tinción inmunohistoquímica de biopsias endobronquiales incluidas en GMA
NOTA: La azida de sodio es tóxica. Prepare la solución de azida de sodio al 0,1% dentro de una campana extractora y lejos de los ácidos. El contacto con los ácidos libera gases tóxicos.
- Dibuja alrededor de las secciones con un bolígrafo con punta de diamante y coloca los portaobjetos en una rejilla para teñir.
- Realiza un bloqueo de peroxidasa. Prepare una solución de bloque de peroxidasa al 0,3% de peróxido de hidrógeno en una solución de azida de sodio al 0,1%. Aplicar 1 ml del bloque de peroxidasa en secciones e incubar durante 30 min.
- Prepare una solución de lavado de solución salina tamponada (TBS) Tris de 0,05 M, pH 7,6. Lave los portaobjetos en TBS, 3x 5 min.
- Prepare una solución de bloque BSA al 1% en DMEM. Haga esto con anticipación y en grandes volúmenes, alícuota y congélelo hasta que lo necesite. Drene los portaobjetos e incube las secciones en solución de bloques durante 30 minutos para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos. Si aún se produce una unión inespecífica, incluya un paso de incubación de 30 minutos con un 5% de bloque de suero de la misma especie que el anticuerpo secundario.
- Diluir el anticuerpo primario (CD45 o CD1a) en TBS hasta la concentración deseada (CD45 diluido a 1:1.000; CD1a diluido a 1:1,00) y aplicarlo sobre portaobjetos. Cubra las secciones e incube durante la noche en RT.
- Lave los portaobjetos en TBS tres veces. Diluir el anticuerpo secundario biotinilado (dirigido contra la especie huésped del anticuerpo primario, en este caso el conejo anti-ratón F(ab'2)) en TBS hasta la concentración deseada (dilución 1:300) y aplicarlo en portaobjetos. Incubar durante 2 horas en RT.
- Prepare un complejo de estreptavidina biotina-peroxidasa al menos 30 minutos antes de usar. Asegúrese de que haya suficiente para cubrir todas las diapositivas. Lave los portaobjetos en TBS tres veces. Aplique la solución a los portaobjetos e incube durante 2 horas en RT.
- Lave los portaobjetos en TBS tres veces. Prepare la solución de sustrato de peroxidasa de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) (elaborada según las instrucciones del fabricante). Aplícalo a los portaobjetos e incuba durante 20-30 min o hasta que se desarrolle la intensidad de tinción deseada.
- Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 5 min. Contramanche las secciones con solución de hematoxilina de Mayer filtrada durante 2 min. Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Drene los portaobjetos y cubra las secciones con un medio de montaje acuoso permanente. Seque los portaobjetos a 80 °C en un horno de secado. Deje que las guías se enfríen y, a continuación, móntelas con DPX y coloque un cubreobjetos.