Aislamiento de exosomas: una técnica para separar exosomas del plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas

Resumen

Fuente: Giallombardo, M., et al. Análisis de miARN exosomal en plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) mediante qPCR: una herramienta factible de biopsia líquida. J. Vis. Exp.(2016).

Los exosomas aislados en plasma se pueden utilizar como una forma no invasiva y repetible para la detección y el seguimiento de los biomarcadores para la detección temprana y la progresión de la enfermedad. Este vídeo describe el protocolo para la separación de exosomas de las muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, que podría utilizarse para extracciones de ADN y proteínas.

Protocolo

1. Aislamiento de exosomas

>Nota: El aislamiento de exosomas a partir de muestras de plasma, se realizó con un kit comercial, de acuerdo con el protocolo del fabricante y añadiendo tratamiento con ARNasa: (todos estos pasos deben realizarse con equipos de protección personal y ambiental y siguiendo el procedimiento legal específico para la manipulación de muestras biológicas).

1. Tome 1 ml de plasma de cada muestra, almacenada a -80 °C, y colóquela en hielo.
2. Centrifugar la muestra a 2.000 × g durante 20 min en RT; este paso es obligatorio para eliminar las células y los residuos.
3. Transfiera el sobrenadante que contiene el plasma limpio a un nuevo tubo de 1,5 ml.
4. Centrifugar el nuevo tubo a 10.000 × g durante 20 min a RT.
5. Transfiera el sobrenadante que contiene el plasma limpio a un nuevo tubo de 1,5 ml.
6. Añadir 100 ng/ml de ARNasa al sobrenadante e incubar el tubo a 37 °C durante 10 min para degradar los ARN circulantes.
7. Transfiera todo el plasma tratado a un nuevo tubo de 2 ml y agregue 0,5 volúmenes de 1x PBS.
8. Agite la muestra para mezclar las soluciones.
9. Añadir 0,05 volúmenes de solución de proteinasa K (incluida en el kit) a la muestra.
10. Agite la muestra y luego incube a 37 °C durante 10 min.
11. Añada 0,2 volúmenes de tampón de precipitación de exosomas a la muestra y mezcle las soluciones por inversión.
12. Incubar la muestra a 2 °C a 8 °C durante 30 min y luego centrifugar la muestra a 10.000 × g durante 5 min a RT.
13. Aspirar y desechar el sobrenadante. El pellet contiene los exosomas aislados.
14. Agregue el tampón seleccionado al gránulo de exosomas para resuspender los exosomas. La selección del búfer depende del análisis posterior previsto, en este caso:
    1. Agregue 100 μl de 1x PBS para realizar el análisis TEM.
    2. Añadir 346,5 μl de tampón de lisis específico para la extracción de ARN (del kit comercial) (ATENCIÓN: peligro químico).
    3. Añadir 100 μl de tampón de lisis para la extracción de proteínas (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptina/Aprotinina 10 μg/ml) para realizar el análisis de Western Blotting. (ATENCIÓN: peligros químicos).
15. Almacene los exosomas resuspendidos a -20 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de aislamiento total de exosomas (a partir de plasma)	Invitrogen	4484450	Usar el tratamiento con proteinasa K
Ribonucleasa A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
RNAspin Illustra mini kit 50	GE HealthCare	25-0500-71

(en inglés)